Beta defensiny 2 a 3 ve sliznici nosních polypů u nemocných s chronickou rinosinusitidou s nosními polypy a s kultivačním nálezem – Staphylococcus aureus na nosní sliznici

Česká verzia English info

Beta Defensins 2 and 3 in Mucosa of Nasal Polyps in Patients with Chronic Rhinosinusitis and Nasal Polyps with a Cultivation Finding of Staphylococcus Aureus on Nasal Mucosa

Chronic sinusitis with nasal polyps is an inflammatory disease, where bacterial infection can participate in etiopathogenesis. Human beta defensins (HBD) are antimicrobial peptides, which represent an important component of inborn mucous immunity.

Objective:
The study investigated whether HBD 2 and 3 are demonstrable at higher levels in nasal polyps as compared with healthy nasal mucosa.

Method:
Before sampling of the nasal polyps, cultivation examination of the secrets from nasal cavity was performed. Samples of healthy nasal mucosa (n = 11) and nasal polyps (n = 49) were processed for light microscopy by fixation in 4% formaldehyde for embedding in paraffin, a portion of the material was frozen in liquid nitrogen at -80°C.

HBD 2 and 3 were detected in paraffin and cryostat sections by immunohistochemical methods by means of three-stage immunoperoxidase technique.

Results:
Staphylococcus aureus was the most often cultivated pathogen in patients with nasal polyps. In clinically healthy nasal mucosa the presence of HBD-2 was determined in individual cells of glandular ducts and in ciliary cells. In the polyp material the presence of HBD-2 was demonstrated at higher amounts than in clinically healthy nasal mucosa. HBD-2 was demonstrated in ciliary cells and cellular cytoplasm of the glandular ducts. HBD-3 was demonstrated in ciliary cells of surface epithelium as well as in the cells of glandular ducts in the polyps. The reaction product of proved HBD-2 occurred at extremely high amounts in the cell cytoplasm of surface epithelium as well as in cells of gland ducts in the polyp samples with demonstrated presence of Staphylococcus aureus.

Conclusion:
It has become obvious that defensins HBD 2 and 3 occurred more often in the tissue of nasal polyps than in healthy nasal mucosa. HBD 3 was demonstrated at extremely high amount in samples of polyps with demonstrated presence of Staphylococcus aureus.

Key words:
beta defensins, nasal polyps, Staphylococcus aureus.

Autoři: Z. Kuchynková ¹; H. Pácová ^1,2; Z. Balatková ¹
Působiště autorů: Klinika otorinolaryngologie a chirurgie hlavy a krku 1. LF UK a FN Motol, Katedra otorinolaryngologie IPVZ, Praha ; přednosta prof. MUDr. J. Betka, DrSc. Ústav pro histologii a embryologii, 1. LF UK, Praha ¹; přednosta doc. MUDr. P. Hach, DrSc. ²
Vyšlo v časopise: Otorinolaryngol Foniatr, 57, 2008, No. 2, pp. 74-78.
Kategorie: Původní práce

Souhrn

Chronická rinosinusitida s nosními polypy je zánětlivé onemocnění, v jehož etiopatogenezi se může uplatňovat bakteriální infekce. Lidské beta defensiny ( human beta defensins, HBD) jsou antimikrobiální peptidy, které představují důležitou složku vrozené slizniční imunity.

Cíl práce:
Cílem bylo zjistit, zda je přítomnost HBD 2 a 3 prokazatelná ve vyšším množství v nosních polypech při porovnání se zdravou nosní sliznicí.

Metoda:
Před odběrem nosních polypů bylo provedeno kultivační vyšetření sekretu z nosní dutiny. Vzorky zdravé nosní sliznice (n = 11) a nosní polypy (n = 9) byly pro světelně mikroskopické zpracování fixovány ve 4% formaldehydu pro zpracování technikou zalití do parafínu, část materiálu byla zamražena v tekutém dusíku při teplotě -80°C.

HBD 2 a 3 byly zjišťovány na parafinových i kryostatových řezech imunohistochemickými metodami pomocí třístupňové imunoperoxidázové techniky.

Výsledky:
Nejčastějším vykultivovaným patogenem u nemocných s nosními polypy byl Staphylococcus aureus. V klinicky zdravé nosní sliznici byla přítomnost HBD-2 zjištěna v jednotlivých buňkách žlázových vývodů a v řasinkových buňkách. V polypózním materiálu byla přítomnost HBD-2 prokázána ve větším množství než u klinicky zdravé nosní sliznice. HBD-2-byl prokazován v řasinkových buňkách a v cytoplazmě buněk žlázových vývodů. HBD-3 byl nalezen v řasinkových buňkách povrchového epitelu i v buňkách žlázových vývodů v polypech. Reakční produkt průkazu HBD-3 se vyskytoval v extremně velkém množství v cytoplazmě buněk, jak povrchového epitelu, tak i v buňkách žlázových vývodů u vzorků z polypů s prokázanou přítomností Staphylococcus aureus.

Závěr:
Zjistili jsme vyšší výskyt defensinů HBD 2 i 3 ve tkáni nosních polypů v porovnání se zdravou nosní sliznicí. HBD 3 byl prokázán v extremně velkém množství u vzorků z polypů s prokázanou přítomností Staphylococcus aureus.

Klíčová slova:
beta defensiny, nosní polypy, Staphylococcus aureus.

ÚVOD

Chronická rinosinusitida je zánětlivé onemocnění nosu a vedlejších nosních dutin. Podskupinu chronické rinosinusitidy představují nemocní s nosními polypy. Etiopatogeneze tohoto onemocnění není dosud zcela objasněna, lze však s vysokou pravděpodobností očekávat multifaktoriální charakter tohoto onemocnění na straně jedné a na straně druhé se může lišit u jednotlivých podskupin onemocnění (4).

Bakteriální infekce je považována za jeden z možným etiologických faktorů. U nemocných s chronickou rinosinusitidou a nosními polypy je častým nálezem Staphylococcus aureus. Zdravá sliznice horních cest dýchacích má řadu velmi účinných mechanismů, kterými se proti bakteriím brání. Teoreticky může být porucha těchto mechanismů příčinou bakteriálního osídlení a může se podílet i na patogenezi chronického zánětu a tvorbě nosních polypů.

Lidské beta defensiny ( human beta defensins, HBD) jsou antimikrobiální peptidy, které představují důležitou složkou vrozené slizniční imunity. Mají jak přímé antibiotické účinky, tak účinky imunomodulační. Beta defensiny se dělí do několika skupiny, beta defensin 1 se na sliznici respiračního traktu vyskytuje konstitučně, defensiny 2 a 3 jsou produkovány jako reakce na infekci.

Cílem naší práce bylo zjistit, zda u nemocných s nosními polypy a nálezem Staphylococcus aureus je produkce defensinů v porovnání se zdravými jedinci zvýšená nebo snížená.

MATERIÁL A METODY

Vzorky klinicky zdravé nosní sliznice (n = 1) byly získány ze zadní části dolní skořepy od pacientů, podstupujících operaci z důvodu deviace nosní přepážky. Materiál z nosních polypů byl získáván v průběhu endoskopických operací od pacientů s klinicky diagnostikovanými nosními polypy (n = 9). U těchto pacientů bylo před výkonem provedeno kultivační vyšetření z nosní dutiny. Sekret byl odebrán endoskopicky ze středního nosního průchodu.

Získaný materiál pro světelně mikroskopické zpracování byl fixován ve 4% formaldehydu (připraveném z paraformaldehydu-PFA v PBS-fosfátový pufr pH 7,4 s osmotickým nastavením dalšími ionty) pro zpracování technikou zalití do parafínu, část materiálu byla zamražena v tekutém dusíku a po celou dobu před krájením v kryostatu uchovávána v hlubokomrazícím boxu při teplotě -80 °C.

HBD 2 a 3 byly zjišťovány na parafinových i kryostatových řezech imunohistochemickými metodami pomocí třístupňové imunoperoxidázové techniky.

Kryostatové řezy pro detekci defensinů byly fixovány ve 4% PFA v PBS. Pro blokování nespecifické vazby bylo použito 2% fetální hovězí sérum (Biosera,UK) po dobu 30 minut. V dalším kroku byly řezy inkubovány s primární protilátkou [Anti-Rabbit-HBD-2 (Peptide Institute, Inc., Japan) 1: 200, Anti-Rabbit-HBD-3 (Orbigen, USA) 1:100] po dobu 60 min. při pokojové teplotě. Po opláchnutí v PBS byly řezy inkubovány s biotinylovanou sekundární protilátkou Goat-Anti-Rabbit IgG v PBS (Sigma-Aldrich, USA) v poměru 1:200 nebo Goat-Anti-Mouse IgG v PBS (Sigma-Aldrich, USA) v poměru 1:400 po dobu 30 min. při pokojové teplotě. Následovalo 3x vyprání v PBS a poté inkubace s Vectastain ABC Elite kit peroxidáze (VECTOR lab., USA) ředěné v PBS pro ABC (1:50) po dobu 30 minut. Po dalším opláchnutí v PBS (po dobu 5 min.) byly vzorky vystaveny působení detekčního roztoku (Diaminobenzidine (DAB) peroxidase substráte solution - DAKO Cytomation, Denmark) do objevení hnědého zbarvení (za vizuální kontroly mikroskopem).

Jádra byla dobarvována kamencovým Harrisovým hematoxylinem po dobu 5 sekund. V případě parafínových řezů bylo po deparafinaci (2 lázně xylenu, 2 lázně 96% etanolu) prováděno odhalení antigenních determinant v TRIS pufru (pH 9,5) v mikrovlnné troubě (1 minuta 560 W a 5 minut 240 W). Aktivita endogenní peroxidázy byla blokována 70% metanolem a 1% peroxidem vodíku po dobu 10 min. při pokojové teplotě. Vlastní imunohistochemická detekce byla prováděna stejným postupem jako u kryostatových řezů.

VÝSLEDKY

Při bakteriologickém vyšetření sekretu při nosní polypóze byl prokázán Staphylococcus aureus u 10 nemocných, Staphylococcus koaguláza negativní u 16 nemocných, negativní výtěr byl u 18, jiný kultivační nález byl u 5 nemocných.

Studie byla zaměřena na detekci dvou podskupin lidského beta defensinu (HBD), a to HBD-2 a HBD-3. I když oba defensiny (HBD-2 a HBD-3) byly prokázány jak v klinicky zdravé tak i v polypózní nosní sliznici, lišily se v intenzitě nakupení reakčního produktu.

V klinicky zdravé nosní sliznici byla přítomnost HBD-2 zjištěna v jednotlivých buňkách žlázových vývodů (obr. 1). Také v povrchovém víceřadém cylindrickém epitelu byl tento defensin (HBD-2) detekován v řasinkových buňkách.

Obr. 1. Přítomnost HBD-2 byla prokázána v cytoplazmě jednotlivých buněk žlázových vývodů v klinicky zdravé nosní sliznici. V sekrečních oddílech žláz nebyla zachycena ložiska reakčního produktu, která by dokládala zastoupení HBD-2 . Imunoperoxidázová reakce (DAB). Dobarveno hematoxylinem. Obj. 40x..

Ve zdravé nosní sliznici byl HBD 3 prokázán v cytoplazmě buněk vývodů žláz (obr. 2).

**Obr. 2. HBD-3 v cytoplazmě buněk vývodů žláz klinicky zdravé nosní sliznice. Imunoperoxidázová reakce (DAB). Dobarveno hematoxylinem. Obj. 63x.**

V polypózním materiálu byla přítomnost reakčního produktu výsledného imunohistochemického průkazu HBD-2 zachycena ve větším množství než u klinicky zdravé nosní sliznice. HBD-2-byl prokazován v bazální části řasinkových buněk povrchového víceřadého cylindrického epitelu (obr. 3) podobně jako v cytoplazmě buněk žlázových vývodů. Výsledky průkazu HBD-2 nebyly kvalitativně odlišné ve vzorcích s pozitivním průkazem Staphylococcus aureus i ve vzorcích bez jeho průkazu.

Obr. 3. HBD 2 byl opakovaně zachycen v bazální oblasti povrchového víceřadého cylindrického epitelu polypózní sliznice s prokázanou přítomností Staphylococcus pyogenes aureus. Imunoperoxidázová reakce (DAB). Obj. 63x.

HBD-3 byl nalezen v bazálních oddílech cytoplazmy řasinkových buněk povrchového epitelu i v buňkách žlázových vývodů v polypech, kdy Staphylococcus aureus nebyl prokázán. Zajímavým nálezem bylo zjištění, že reakční produkt průkazu HBD-3 se vyskytuje v extremně velkém množství v cytoplazmě buněk, jak povrchového epitelu (obr. 4), tak i v buňkách žlázových vývodů u vzorků z polypů s prokázanou přítomností Staphylococcus aureus.

Obr. 4. Významně větší nakupení reakčního produktu HBD- 3 v buňkách povrchového víceřadého cylindrického epitelu ve sliznici polypu s prokázaným Staphylococcus pyogenes aureus. Imunoperoxidázová reakce (DAB). Dobarveno hematoxylinem. Obj. 63x.

DISKUSE

Skupina nemocných s chronickou rinosinusitidou s nosními polypy a kultivačním nálezem Staphylococcus aureus, je jasně definovaná, ale i tak je zcela jistě nehomogenní. Pro další přesnější klasifikaci bychom mohli rozdělovat nemocné dále například podle anamnestického údaje o intoleranci kyseliny acetylosalicylové, bronchiálním astmatu, alergii, cystické fibróze, kortikoterapii nebo podle histologického nálezu tkáňové eozinofilie.

Staphylococcus aureus je uváděn jako nejčastější patogen u nemocných s chronickou rinosinusitidou s nosními polypy (9). Tomuto údaji odpovídá také nález v našem souboru nemocných, kde byl sice kultivačně četnější Staphylococcus koaguláza negativní, který ale na nosní sliznici není považován za patogenní bakterii. HBD 2 působí na bakterii Staphylococcus aureus bakteriostaticky, HBD 3 baktericidně (13).

Sledovali jsem beta defensiny, které představují klíčovou složku přirozené slizniční imunity. Defensiny patří do skupiny antimikrobiálních peptidů. Na povrch respirační sliznice se dostávají jako součást serózní sekrece, která má původ ve žlázách a buňkách. V serózní složce sekretu pokrývajícího respirační sliznici jsou i další antimikrobiální peptidy, a to lysozym a laktoferin (3). Tyto látky se do sekretu dostávají z epiteliálních buněk, serózních buněk submukózních žlaz a z krve. Tomu v naší práci odpovídá i průkaz defensinů, a to v bazální části epitelových buněk a ve vývodech submukózních žláz respirační sliznice horních dýchacích cest. Hodnotili jsme beta defensin 2 a 3, které jsou syntetizovány jako reakce na infekci (11, 13, 14, 15).

HBD 2 jsme prokázali ve zdravé sliznici, ale jen v jednotlivých buňkách. Tento nález souhlasí s výsledky prací jiných autorů (2, 6) a je v rozporu s jednou prací, kde HBD 2 ve zdravé sliznici nebyly zjištěny (8). HBD 2 jsme našli výrazně v nosních polypech v porovnání se zdravou sliznicí, což odpovídá řadě publikovaných nálezů (1, 6, 8). Nejvýraznější zvýšení HBD 2 bylo potvrzeno u polypů nemocných s cystickou fibrózou (2).

HBD 3 v nosní sliznici zatím nebyly příliš zkoumány. Je publikována jedna práce, kde HBD 3 nebyly prokázány ani ve zdravé sliznici ani v polypech (2). Prokázali jsme minimální přítomnost HBD 3 ve zdravé sliznici a nápadně vyšší přítomnost ve tkáni nosních polypů.

Je možno předpokládat, že defensiny ovlivňují náchylnost k bakteriální infekci a mohou přispívat k zvýšené produkci cytokinů a chemokinů (10). V porovnání se zdravou nosní sliznicí jsme prokázali vyšší výskyt defensinů u nemocných se zánětlivým onemocněním nosu, tedy nosní polypózou a nosní polypózou provázenou bakteriální infekcí. V současné době víme, že defensiny se uplatňují v patogenezi dvou jiných zánětlivých onemocněních sliznice, a to Crohnovy choroby (16) a cystické fibrózy (5).

Do budoucna bude zajímavé a přínosné sledovat výskyt defensinů ve vztahu k receptorům, u kterých se předpokládá jejich spolupráce s defensiny a jejich účast v patogenezi chronického zánětu u chronické rinosinusitidy s nosní polypózou. Mezi tyto receptory patří především toll like receptory (1, 12).

ZÁVĚR

Zjistili jsme vyšší výskyt defensinů HBD 2 i 3 ve tkáni nosních polypů v porovnání se zdravou nosní sliznicí. Velmi nápadná byla přítomnost HBD 3 v nosních polypech s kultivačním nálezem – Staphylococcus aureus.

Práce byla podporována grantem NR8440-3/2005.

Došlo 31. 12. 2007 Doc. MUDr. Zdeňka Kuchynková, CSc.

Klinika ORL a chirurgie hlavy a krku 1. LF UK a FN Motol

V Úvalu 84

150 06 Praha 5–Motol

e-mail: Z.Kuchynkova@gmail.com

Zdroje

1. Claeys, S., de Belder, T., Holtappels, G., Gevaert, P., Verhasselt, B., van Cauwenberge, P., Bachert, C.: Human beta-defensins and toll-like receptors in the upper airway. Allergy., 58, 2003, s. 748-753.

2. Claeys, S., Van Hoecke, H., Holtappels, G., Gevaert, P., De Belder, T., Verhasselt, B., Van Cauwenberge, P., Bachert, C.: Nasal polyps in patients with and without cystic fibrosis: a differentiation by innate markers and inflammatory mediators. Clin. Exp. Allergy., 35, 2005, s. 467-472.

3. Cole, A. M., Liao, H. I., Stuchlik, O., Tilan, J., Pohl, J., Ganz, T.: Cationic polypeptides are required for antibacterial activity of human airway fluid. J. Immunol., 169, 2002, s. 6985-6991.

4. Fokkens, W., Lund, V., Mullol, J.: European position paper on rhinosinusitis and nasal polyps group 2007. Rhinol, Suppl., 20, 2007, s. 1-136. Review.

5. Chen, C. I., Schaller-Bals, S., Paul, K. P., Wahn, U., Bals, R.: Beta-defensins and LL-37 in bronchoalveolar lavage fluid of patients with cystic fibrosis. J. Cyst. Fibros. 3, 2004, s. 45-50.

6. Chen, P. H., Fang, S. Y.: Expression of human beta-defensin 2 in human nasal mucosa. Eur Arch. Otorhinolaryngol., 261, 2004, s. 238-241.

7. Kao, C. Y., Chen, Y., Thai, P., Wachi, S., Huang, F., Kim, C., Harper, R. W., Wu, R.: IL-17 markedly up-regulates beta-defensin-2 expression in human airway epithelium via JAK and NF-kappaB signaling pathways. J. Immunol., 173, 2004, s. 3482-3491.

8. Lee, S. H., Kim, J. E., Lim, H. H., Lee, H. M., Choi, J. O.: Antimicrobial defensin peptides of the human nasal mucosa. Ann. Otol. Rhinol. Laryngol., 111, 2002, s. 135-1341.

9. Lin, A., Busaba, N. Y.: Staphylococcus aureus and endoscopic sinus surgery. Cur.r Opin Otolaryngol Head Neck Surg., 14, 2006, s.19-22. Review.

10. Menendez, A., Brett Finlay, B.: Defensins in the immunology of bacterial infections. Curr Opin Immunol., 19, 2007, s. 385-391.

11. Ouhara, K., Komatsuzawa, H., Shiba, H., Uchida, Y., Kawai, T., Sayama, K., Hashimoto, K., Taubman, M. A., Kurihara, H., Sugai, M.: Actinobacillus actinomycetemcomitans outer membrane protein 100 triggers innate immunity and production of beta-defensin and the 18-kilodalton cationic antimicrobial protein through the fibronectin-integrin pathway in human gingival epithelial cells. Infect. Immun., 74, 2006, s. 5211-5220.

12. Ramanathan, M. Jr, Lee, W. K., Dubin, M. G., Lin, S., Spannhake, E. W., Lane, A. P.: Sinonasal epithelial cell expression of toll-like receptor 9 is decreased in chronic rhinosinusitis with polyps. Am. J. Rhinol., 21, 2007, s. 110-116.

13. Schibli, D. J., Hunter, H. N., Aseyev, V., Starner, T. D., Wiencek, J. M., McCray, P. B. Jr, Tack, B. F., Vogel, H. J.: The solution structures of the human beta-defensins lead to a better understanding of the potent bactericidal activity of HBD3 against Staphylococcus aureus. J. Biol. Chem., 277, 2002, s. 8279-8289.

14. Singh, P. K., Jia, H. P., Wiles, K., Hesselberth, J., Liu, L., Conway, B. A., Greenberg, E. P., Valore, E. V., Welsh, M. J., Ganz, T., Tack, B. F., McCray, P. B. Jr.: Production of beta-defensins by human airway epithelia. Proc. Natl. Acad. Sci U S A., 95, 1998, s. 4961-4966.

15. Voss, E., Wehkamp, J., Wehkamp, K., Stange, E. F., Schröder, J. M., Harder, J.: NOD2/CARD15 mediates induction of the antimicrobial peptide human beta-defensin-2. J Biol. Chem., 281, 2006, s. 2005-2011.

16. Wehkamp, J., Schmid, M., Stange, E. F.: Defensins and other antimicrobial peptides in inflammatory bowel disease. Curr Opin Gastroenterol., 23, 2007, s. 370-378. Review.