Senzory budoucnosti – elektrochemie jako nástroj pro detekci onkovirů a jiných biomarkerů

Pro většinu lidí představují viry jen nepříjemnou sezónní epizodu, která tu a tam přeroste v epidemii a výjimečně i v pandemii. V onkologii ale hrají mnohem sofistikovanější roli: stávají se tichými spoluhráči, spolupachateli, nebo rovnou hlavními viníky v procesu nádorového bujení. Říkáme jim onkoviry: viry, které se podílejí na vzniku nebo progresi zhoubných nádorů a které „mají prsty“ až v 15–20 % všech lidských karcinomů. Některé, jako lidský papilomavirus (HPV) u karcinomu děložního hrdla nebo virus Epsteina-Barrové (EBV) u lymfomů, jsou dnes již dobře známými aktéry v onkologii. Některé viry však zůstávají mimo záři reflektorů –⁠ např. lidský cytomegalovirus (hCMV), což je herpesvirus, který si většina z nás nese v těle a který se nevydává klasickou onkogenní cestou, ale spíše nenápadně ovlivňuje nádorové mikroprostředí, imunitní odpověď i buněčné signalizační dráhy. V gliomech, především u glioblastomu, se opakovaně prokazuje přítomnost hCMV, a to na úrovni DNA, RNA i proteinů. Přímá kauzální souvislost však zůstává nejasná. Přesto právě onkomodulační vliv hCMV představuje fascinující oblast výzkumu: jak virus, který je v normální tkáni často neškodný, dokáže ve spolupráci s nádorem rozpoutat bouři. Na rozdíl od klasických onkovirů, které často zasahují přímo do genomu a transformují buňky, hCMV v gliomech spíš přizvukuje, než diriguje. Kupříkladu zvyšuje expresi proangiogenních faktorů (např. VEGF), podporuje nádorovou invazivitu nebo ovlivňuje apoptózu i metabolismus nádorových buněk. Navíc má silně imunomodulační účinky –⁠ umí tlumit prezentaci antigenů, potlačovat cytotoxickou odpověď a přispívat k tvorbě imunosupresivního mikroprostředí. Zkrátka, gliomům hraje do noty, aniž by sám hrál hlavní roli. Co ale činí celou oblast ještě záhadnější –⁠ a pro některé frustrující –⁠ je kontroverzní důkaz přítomnosti hCMV ve vzorcích glioblastomu. Zatímco některé studie nacházejí virovou DNA nebo proteiny až ve 100 % vzorků, jiné –⁠ při použití odlišných metod –⁠ nenacházejí vůbec nic. Rozdíly mohou vycházet z použité metodiky (PCR vs. imunohistochemie vs. in situ hybridizace), kvality fixace tkání, ale možná i z biologické heterogenity samotného nádoru. V důsledku toho se hCMV ocitá na tenkém ledě mezi „nádorovým spolupachatelem“ a „neškodným kolemjdoucím“. Jisté ale je, že výzkum jeho role přináší nové otázky, včetně možných terapeutických cílů.

Detekce virových sekvencí v nádorových tkáních je jen jednou z mnoha oblastí, kde se ukazuje, že tradiční metody mají své limity. Se zvyšujícími se nároky na rychlost, přesnost a dostupnost diagnostiky roste zájem o nové analytické technologie, které by mohly doplnit nebo částečně nahradit klasické molekulárně biologické přístupy. Tento vývoj se netýká pouze onkovirů, ale i detekce širokého spektra nádorových biomarkerů –⁠ od proteinových markerů přes genetické mutace, nekódující RNA a metylace až po cirkulující nádorovou DNA. Tyto biomarkery významně ovlivňují časnou diagnostiku, monitorování léčby i prognózu pacienta. Jedním z nadějných směrů jsou i elektrochemické biosenzory, které si začínají nacházet cestu z laboratoří do klinického výzkumu. Elektrochemické metody mohou na první pohled znít jako něco, co patří spíš do hodin chemie nebo fyziky než jako nástroj pro onkologii. Opak je ale pravdou, za což velkou měrou vděčíme i významnému českému vědci a brněnskému rodáku prof. Emilu Palečkovi. Právě on totiž na konci 50. let 20. století jako první popsal elektrochemickou aktivitu DNA, čímž s nadsázkou položil základy dnešní dynamicky se rozvíjející oblasti DNA biosenzorů. Princip těchto metod lze stručně popsat jako zachycení cílových biomarkerů, například DNA, RNA nebo proteinů, na povrchu elektrody (příp. jiného pevného substrátu), k čemuž slouží tzv. bioreceptory, tedy biomolekuly, které se specificky vážou na hledanou molekulu. Nejčastěji se používají DNA sondy (pro zachycení DNA a RNA), protilátky nebo aptamery (pro detekci proteinů) a také lektiny, které rozpoznávají cukerné složky u glykoproteinů. Po navázání dochází ke změnám elektrického proudu nebo potenciálu, které lze měřit a jež signalizují přítomnost konkrétního biomarkeru.

Naše laboratoř elektrochemie na Masarykově onkologickém ústavu se již dlouhodobě věnuje vývoji těchto nových metod a technologií pro detekci různých nádorových biomarkerů, zejména nukleových kyselin. Kromě rutinní metody PCR si přitom pomáháme také izotermálními amplifikačními technikami, které dokážou namnožit DNA nebo RNA při konstantní teplotě, a tak nevyžadují speciální přístroj pro cyklování teplot. Jsou i rychlejší, energeticky méně náročné a vhodné pro přenosná nebo point-of-care zařízení. Jednou z nejčastěji využívaných metod je LAMP (z angl. loop-mediated isothermal amplification), která umožňuje rychlou a citlivou detekci cílových sekvencí i v náročných podmínkách. LAMP je obzvlášť vhodná pro analýzu patogenů vč. onkovirů a lze ji efektivně kombinovat s elektrochemickou detekcí. Kombinaci těchto metod jsme např. využili k analýze vysoce rizikových kmenů HPV u prekanceróz děložního hrdla, a to nejen pro zjištění přítomnosti infekce [1], ale také k detekci integrace HPV do genomu hostitele, což umožňuje posoudit virovou aktivitu, a tím i pravděpodobnost progrese onemocnění [2]. Jinými slovy, nejenže tam virus najdeme, ale taky ho chytíme při činu. Náš současný výzkum se teď zaměřuje právě i na model hCMV, kde elektrochemii porovnáváme s rutinně používanými technikami typu qPCR nebo imunohistochemie na kohortě >100 pacientů s glioblastomem. LAMP technika s elektrochemickou detekcí se ovšem výborně osvědčila i při analýze PCA3 [3], tj. dlouhé nekódující RNA nadměrně exprimované u karcinomu prostaty, která slouží jako biomarker pro jeho detekci v moči, nebo při stanovení mutace V600E v genu BRAF [4], která je klíčovým onkogenním aktivátorem signalizační dráhy MAPK a významným prediktorem odpovědi na cílenou terapii u několika typů nádorů. I jiné izotermální techniky jsou dobře kombinovatelné s měřením na elektrodách, a to zejména technika RCA (z angl. rolling circle amplification), která je do češtiny trochu kostrbatě překládána jako amplifikace otáčivou kružnicí, nebo dokonce jako amplifikace valivým kruhem. Tak jako tak, RCA umožňuje vysoce selektivní amplifikaci různých mutovaných variant genů, což jsme nedávno demonstrovali na mutaci G12V u onkogenu KRAS [5], která patří mezi nejčastější mutace u solidních nádorů a má zásadní význam pro diagnostiku, prognózu i volbu cílené terapie.

Shrňme tedy hlavní výhody elektrochemie. Jsou to rychlost, nízké náklady, miniaturizace a možnost jejího použití přímo u pacienta (tzv. point-of-care). Na rozdíl od imunohistochemie, PCR nebo sekvenování nové generace není potřeba náročná příprava vzorku ani drahé vybavení. Kromě toho lze senzory snadno upravit na různé cílové molekuly, což z nich dělá velmi flexibilní nástroj pro výzkum i budoucí diagnostiku v rámci decentralizované medicíny. A i když zatím není součástí běžné klinické praxe, elektrochemie v onkologii má potenciál změnit způsob, jak přistupujeme k detekci nemoci –⁠ a možná i k jejímu pochopení.