Vyšetření mutačního statutu genu KRAS jako součást algoritmu léčby metastatického kolorektálního karcinomu

Souhrn

Cílená léčba se stává součástí standardních terapeutických postupů zhoubných nádorů. V případě karcinomu tlustého střeva a konečníku je to nejčastěji terapie pomocí monoklonálních anti-EGFR protilátek (cetuximab a panitumumab). Aktivační somatické mutace v kodonech 12 a 13 exonu 2 genu KRAS jsou negativním prediktivním faktorem léčebné odpovědi na anti-EGFR terapii u pacientů s metastatickým kolorektálním karcinomem. V České republice se provádí vyšetření genu KRAS v několika referenčních laboratořích. V roce 2009 bylo v těchto laboratořích provedeno 2580 vyšetření mutačního statutu genu KRAS, z nichž bylo 60,2 % případů nemutovaných, tedy wild-type KRAS. Na příkladu jedné laboratoře je demonstrována logistika vyšetřování mutačního statutu genu KRAS. Stratifikace pacientů s metastatickým kolorektálním karcinomem zvažovaných pro cílenou anti-EGFR terapii na základě přítomnosti mutací v kodonech 12 a 13 genu KRAS je dnes standardním postupem. Laboratoř provádějící toto vyšetření by měla postupovat v souladu s doporučeními odborných společností.

Klíčová slova:
k-ras, kolorektální karcinom, cílená léčba, anti-EGFR terapie, prediktivní molekulární onkologie, standardizace diagnostických procesů.

ÚVOD

Zhoubné onemocnění tlustého střeva (dg. C18), rektosigmoideálního spojení (C19) a konečníku (C20) je jednou z nejčastějších malignit v České republice. Nejčastější léčebnou modalitou u kolorektálního karcinomu je kurativní resekce nádoru. Pacientům s karcinomem tlustého střeva klinického stadia II „high risk“ podskupiny a stadia III je indikována po odstranění nádoru adjuvantní chemoterapie. U karcinomu rekta stadia II a III je u lokálně pokročilého onemocnění indikována neoadjuvantní chemoradioterapie a chemoterapie či konkomitantní chemoradioterapie v adjuvanci. Pro terapii metastatického onemocnění stadia IV a lokálně pokročilého inoperabilního onemocnění se využívá kombinace chemoterapie s cílenou léčbou (případně cílená léčba v monoterapii), a to především monoklonálními protilátkami proti VEGF (bevacizumab) a anti-EGFR mAb (cetuximab, panitumumab).

Zhoubné nádory tlustého střeva a konečníku mají v některých případech hereditární či familiární výskyt (1), nicméně velká většina kolorektálních nádorů je sporadické etiologie vznikající z adenomatózních polypů. V genetickém modelu kumulace alterací vedoucích ke vzniku maligní buňky z epitelu kolorekta se popisuje především mutace nádorových supresorů APC (adenomatous polyposis coli) a p53 a onkogenu KRAS (2). Gen KRAS (Ki-ras2 – Kirsten rat sarcoma virus oncogene homolog) je onkogen, který kóduje malý protein s GTPázovou aktivitou podílející se na intracelulární signalizaci. Proteinový produkt tohoto genu se účastní regulace buněčného dělení přenosem signálu z vnějšku buňky do buněčného jádra; jeho aktivní forma s navázaným GTP má centrální úlohu v transdukci mitogenních signálů. 

GEN KRAS

Gen KRAS (OMIM 190070) patří spolu se strukturně a funkčně homologními geny HRAS a NRAS do skupiny onkogenů RAS (3). Gen KRAS leží na chromozomu 12 v oblasti 12p12.1 a kóduje dvě izoformy A a B (obr. 1), z nichž výrazněji převažuje sestřihová varianta KRASB (4).

Vazba GTP na k-ras a tedy jeho aktivita je regulována pomocí RasGAP (GAP – GTPase activating protein), které urychlují hydrolýzu GTP na GDP, a tedy přechod proteinu ras do inaktivní formy (5). Do aktivní formy se protein ras dostává působením proteinů RasGEF (GEF – guanine nucleotide exchange factor), které navozují disociaci GDP, které je nahrazeno GTP, a protein tak přechází do aktivního stavu (6). Aktivační mutace genu KRAS znemožňují hydrolýzu GTP na GDP, a tím přechod aktivní formy proteinu ras na neaktivní. Onkogenní mutace genu KRAS se zpravidla vyskytují v oblastech ovlivňujících hydrolýzu GTP, např. mutace v kodonu 12 vedoucí k záměně glycinu za aminokyselinu s postranním řetězcem má za následek sterickou interferenci s hydrolýzou GTP navozenou GAP (7); glutamin v pozici 61 umožňuje vazbu s GAP p120 a následnou hydrolýzu GTP (7–9). Díky onkogenním somatickým mutacím získává buňka konstitutivně aktivní protein k-ras bez ohledu na aktivační nebo deaktivační signály přicházející z membránových receptorů, které jsou v aktivační kaskádě hierarchicky postaveny nad proteinem k-ras. Typickým příkladem receptoru aktivujícího protein k-ras je receptor pro epidermální růstový faktor EGFR. K aktivaci (fosforylaci) intracelulární tyrozinkinázové domény EGFR dochází na základě navázání ligandu na receptor a RasGEF pak zprostředkují aktivaci proteinu k-ras (10).

Terapeutická inhibice receptoru EGFR se v posledních letech využívá v léčbě celé řady epiteliálních nádorových onemocnění. Klinicky nejčastěji používané inhibitory jsou mono­klonální protilátky (anti-EGFR mAb, cetuximab a panitumumab) nebo nízkomolekulární inhibitory tyrozinkinázové domény EGFR (TKI – erlotinib, gefitinib a lapatinib). Míra imunohistochemicky stanovené exprese EGFR u kolorektálního karcinomu se neukázala být prediktorem léčebné odpovědi na anti-EGFR mAb (11–13).

Testování genu KRAS má zásadní klinický význam u pacientů s metastatickým kolorektálním karcinomem. Dvě velké klinické studie CRYSTAL a OPUS hodnotily benefit z přidání cetuximabu k režimu FOLFIRI (leukovorin, 5-fluorouracil, irinotecan), respektive FOLFOX (leukovorin, 5-fluo­rouracil, oxaliplatina), v první linii u pacientů s metastatickým kolorektálním karcinomem (mCRC). Z metaanalýzy těchto studií vyplynulo, že mutační status genu KRAS může být prediktorem odpovědi na léčbu anti-EGFR protilátkami (14, 15). Analýzou těchto klinických hodnocení a dalších retrospektivních studií bylo prokázáno, že aktivační somatické mutace v  kodonech 12 a 13 exonu 2 genu KRAS jsou negativním prediktivním faktorem léčebné odpovědi na cetuximab u pacientů s mCRC (16–20). Z těchto studií také vycházejí doporučení ASCO (American Society of Clinical Oncology; www.asco.org), NCCN (National Comprehensive Cancer Network; www.nccn.org) a CAP (College of American Pathologists; www.cap.org) týkající se testování mutací genu KRAS u pacientů s mCRC zvažovaných k terapii anti-EGFR mAb. Tyto organizace doporučují testování genu KRAS u všech kandidátů pro léčbu anti-EGFR terapií a konkrétně v USA výhradně v laboratořích postupujících podle CLIA (Clinical Laboratory Improvement Amendments, www.cms. gov/clia, zákonný předpis stanovující normy na zajištění kvality v klinických laboratořích v USA). V případě záchytu mutace v kodonech 12 a 13 by pacient s mCRC neměl dostat terapii anti-EGFR mAb jako součást standardní léčby (21). Testování právě těchto substitucí vyplývá především z faktu, že mutace v kodonech 12 a 13 představují 90 % alterací v genu KRAS zachycených u kolorektálního karcinomu (22). V souvislosti s dalšími onkogenními mutacemi genu KRAS (viz obr. 1) někteří autoři navrhují testování genu KRAS rozšířit o testování kodonů 61 a 146 (23, 24), což bude předmětem retrospektivních studií hodnotících prediktivní hodnotu těchto mutací (24, 25). Z dalších studií vyplývá prediktivní hodnota mutace genu BRAF u mCRC v souvislosti s anti-EGFR terapií. Cytoplazmatická serin/threonin kináza B-raf je součástí intracelulární signalizace (RAS-RAF--MEK-ERK-MAPK) (28). Nejčastější mutací (90 %) v tomto genu je transverze T na A vedoucí k zařazení glutamové kyseliny místo valinu (V600E) a mnohonásobně vyšší kinázové aktivitě proteinu B-raf a indukci buněčné proliferace a transformace (27, 28). Mutace BRAF V600E se zpravidla vzájemně vylučuje s mutací v genu KRAS a testování této mutace může dále stratifikovat skupinu pacientů wild-type KRAS mCRC z hlediska pravděpodobné odpovědi na anti‑EGFR mAb (29).

TESTOVÁNÍ

Pro testování genu KRAS je vyšetřovaným materiálem nádorová tkáň pocházející zpravidla z resekátu v rámci kurativního odstranění primárního tumoru. Standardním zpracováním takovéto tkáně pro diagnostické účely je fixace ve formaldehydu a zalití do parafínového bločku (FFPE – formalin-fixed parafin-embedded). Správné zpracování nádorového materiálu je zásadní pro získání kvalitní DNA pro detekci mutací. Kvalita DNA izolované z fixovaného materiálu je závislá na celé řadě faktorů, především na typu fixativa, jeho pH a délce fixace. Formaldehyd, účinná složka formalínu, reaguje s nukleovými kyselinami a proteiny a vede k tvorbě křížových kovalentních vazeb (cross-link) uvnitř DNA mezi sousedními bázemi a mezi DNA a ostatními molekulami. Současnými metodami nejsou crosslinky DNA-DNA zcela efektivně odstranitelné. Crosslinky nezpůsobují problém při izolaci DNA, ale blokují amplifikaci DNA pomocí PCR. Sterická inhibice DNA polymerázy může v průběhu PCR výrazně ovlivnit účinnost amplifikace DNA získané z tkáně fixované formaldehydem. Důsledkem podmínek procesu fixace, např. extrémně nízké pH, dochází k fragmentaci nukleových kyselin. Prodlužování fixační doby tak může vést k výraznému snižování kvality DNA spojené zejména se zmenšením velikosti amplifikovatelných fragmentů (30). Doporučuje se proto provést krátkodobou fixaci v neutrálním formaldehydu nebo přípravku RNAlater. 

DETEKCE

Pro detekci mutací genu KRAS je využívána celá řada molekulárních metod, např. metody založené na přímém sekvenování (Sangerovo sekvenování a pyrosekvenování), na polymorfismu délky restrikčních fragmentů (RFLP – restriction fragment length polymorphism), na alelově specifických sondách (ASO – allele-specific oligonucleotide), na analýze teplot křivek tání s vysokým rozlišením (HRMA – high-resolution melting analysis), na modifikaci alelově specifické PCR (ARMS – amplification refractory mutation system) a na denaturační vysokoúčinné kapalinové chromatografii (DHPLC – denaturing high performance liquid chromatography). Výhodou přímého sekvenování je záchyt všech mutací v sekvenovaném úseku DNA. Hlavní nevýhodou sekvenování je nízká citlivost záchytu mutací na pozadí nemutovaného genu z nádorových i nenádorových buněk. U Sangerova sekvenování se uvádí možnost detekce mutace, pokud je zastoupena minimálně v 10–30 %. Pyrosekvenování poskytuje vyšší citlivost záchytu mutace (5–10 % mutovaného genu KRAS na pozadí nemutovaného genu), v současnosti se ale nejedná o laboratorní technologii běžně rozšířenou a dostupnou k rutinnímu testování mutací. Výhodou real time PCR je její snadná proveditelnost, krátké časy odezvy, uzavřený systém snižující pravděpodobnost kontaminace a vysoká senzitivita (1%) záchytu mutací na pozadí nemutovaného genu. Nevýhodami alelově specifického přístupu jsou vyšší cena a vyšetření pouze testem limitovaných mutací (31). 

STANDARDIZACE PROCESŮ

Klíčové oblasti standardizace procesů v klinických laboratořích jsou odborná způsobilost pracovníků laboratoře, dokumentovaná a faktická standardizace postupů, kontrola kvality laboratorních výsledků a akreditace laboratoří dle relevantní normy (např. ČSN EN ISO15189, ČSN EN ISO17025). Doporučení pro standardizaci diagnostických postupů, ze kterých mohou laboratoře vyšetřující gen KRAS vycházet, jsou ASCO Provisional Clinical Opinion (21) odkazující na CAP POET (Perspectives on Emerging Technologies) aktualizované na http://www.cap.org/POET, doporučení NCCN týkající se testování genu KRAS (www.nccn.org), a doporučení European Society of Pathology (http://esp-pathology.org, (32)). Z doporučení těchto autorit vyplývá, že:

• Vzorky nádorové tkáně všech pacientů s metastatickým kolorektálním karcinomem, u nichž je zvažována terapie anti-EGFR protilátkami, by měly být testovány na přítomnost mutace v genu KRAS.
• Vyšetřovaným materiálem může být čerstvý, čerstvě zmražený nebo FFPE vzorek primárního tumoru nebo vzdálené metastázy.
• Oblast vzorku, ze které bude provedena izolace DNA, určuje vždy kvalifikovaný patolog, a to tak, aby vyšetřovaným materiálem byly nádorové buňky. Vhodné je rovněž kvantifikovat relativní zastoupení nádorových buněk. Minimální nutné zastoupení maligních buněk ve vyšetřovaném vzorku závisí na použité metodě detekce, v optimálním případě by to mělo být 70 % a více.
• Laboratoř provádějící molekulární vyšetření by měla volit nejlepší dostupnou metodu nebo kombinaci metod s ohledem na správnost, specificitu a senzitivitu stanovení.
• Mutační analýza genu KRAS by měla zahrnovat minimálně sedm nejčastějších mutací v kodonech 12 a 13.

Nejpoužívanějšími testy jsou metody založené na real time PCR nebo přímém sekvenování exonu 2. V Evropě jsou v současnosti komerčně dostupné certifikované kity TheraScreen (DxS): K-RAS Mutation Kit pro použití na LightCycler^® 480 Instrument II (Roche) a KRAS LightMix (TIB MolBiol) založené na alelově specifické real time PCR; PyroMark KRAS Kit (Qiagen) na principu pyrosekvenování; StripAssay PGX‑Kras (ViennaLab) založený na hybridizaci PCR produktu na detekčním proužku; a SURVEYOR^® Scan K-RAS Mutation Detection Kit CE IVD (Transgenomic) pro detekci mutací pomocí DHPLC.

Pokud laboratoř provádí vyšetření pomocí komerční soupravy bez CE certifikace nebo vlastní vyvinutou tzv. home-brew metodou, měla by mít metodu doložitelně validovanou z hlediska její správnosti a reprodukovatelnosti. Klíčové organizace zabývající se zajištěním kvality v klinických laboratořích začínají poskytovat programy na externí kontrolu kvality analýzy genu KRAS. V programu CAP proficiency testing je k dispozici testování genu KRAS od roku 2010; program pro rok 2010 má dva cykly, vyšetřovaným materiálem jsou tři nebarvené řezy tkáně z parafínového bločku jednoho nádoru, které jsou doplněny o dvě skla s tkání barvenou hematoxylinem, podle níž patolog určí oblast řezu pro izolaci DNA obsahující nádorové buňky. Podle  výsledků CAP proficiency testing z roku 2010, kterého se účastnilo 134 laboratoří, většina participantů využívá komerčně dostupnou soupravu (37 %) nebo Sangerovo sekvenování (38 %) a metodou získání nádorových buněk pro analýzu je dominantně makrodisekce (51 %) a manuální mikrodisekce (28 %). Kodon 61 vyšetřuje 19 % účastníků CAP proficiency testing. Ve fázi pilotních programů je od roku 2009 externí hodnocení kvality organizované ESP (European Society of Pathology) KRAS European Quality Assurance Program (http://kras.eqascheme.org/) a UK NEQAS (United Kingdom National External Quality Assessment Service; http://www.ukneqas-molgen.org.uk). Od roku 2010 organizuje externí hodnocení kvality pro mutace v genu KRAS také německý Referenzinstitut für Bioanalytik. 

VYŠETŘENÍ GENU KRAS V ČESKÉ REPUBLICE

V České republice se provádí vyšetření genu KRAS v několika laboratořích komplexních onkologických center: Všeobecná fakultní nemocnice a Fakultní Thomayerova nemocnice s poliklinikou v Praze, Fakultní nemocnice v Hradci Králové, Masarykův onkologický ústav v Brně, Fakultní nemocnice v Olomouci a v nestátních akreditovaných laboratořích: Bioptická laboratoř s.r.o. v Plzni, P & R LAB a.s. v Novém Jičíně a CGB laboratoř a.s. v Ostravě. Vyšetřování genu KRAS je v České republice prováděno od poloviny roku 2008 s výraznějším vzestupem počtu testů v říjnu 2008. Celkově bylo za posledních 6 měsíců roku 2008 provedeno v České republice 418 vyšetření genu KRAS. V roce 2009 bylo provedeno v České republice 2580 vyšetření mutačního statutu genu KRAS, tj. průměrně 215 vyšetření za měsíc. Všechny laboratoře vyšetřují aktivační mutace v kodonech 12 a 13 uvedené na obrázku 1. Z celkového počtu vyšetřených vzorků bylo interpretovaných jako wild-type KRAS 60,2 %, a to bez výrazného rozptylu mezi laboratořemi; pracoviště s nejvyšším záchytem wild-type forem KRAS vykazovalo 66,5 % nemutovaných a pracoviště s nejnižším záchytem mutací vykazovalo 55,2 % wild-type (obr. 2). Přítomnost somatických mutací u metastatického kolorektálního karcinomu zachycených v České republice tak odpovídá údajům z klinických hodnocení OPUS a CRYSTAL (14, 15). Celkové pořadí četnosti mutací vyšetřovaných na všech pracovištích je G12D (11,9 % všech výsledků), G12V (8,8 %), G13D (5,8 %), G12C (3,3 %), G12A (2,8 %), G12S (2,0 %), G12R (1,0 %). Jedna laboratoř vyšetřuje kodon 13 na přítomnost dalších záměn s tímto výsledkem záchytu: G13S a G13A nezachyceny, G13R a G13V – 0,1 %, G13C – 0,3 %. Žádné pracoviště neuvedlo testování mimo kodony 12 a 13 genu KRAS.

V Masarykově onkologickém ústavu se provádí stanovení mutací genu KRAS od druhé poloviny roku 2008. Postup vyšetřování je popsán algoritmem na obrázku 3. Zpracování tkáně provádí Oddělení onkologické a experimentální patologie a část tkáně pro izolaci DNA pak převezme Laboratoř prediktivní onkologie Oddělení laboratorní medicíny, které reportuje výsledek žadateli. Vyšetření mutačního statutu genu KRAS je akreditováno dle ČSN EN ISO15189 (35) a provádí se metodou real time PCR (kit TheraScreen, DxS); záložní metodou je hybridizace PCR produktu na detekčním proužku (PGX-Kras, ViennaLab). Externí hodnocení kvality je prováděno v programu CAP proficiency testing (www.cap.org). Analýza času odezvy metody v MOÚ (obr. 3) ukazuje, že časově nejnáročnější jsou činnosti spojené se zpracováním tkání, především vyžádání a následné dodání tkání z pracovišť mimo Masarykův onkologický ústav. Doba odezvy se výrazně prodlouží, pokud není izolovaná DNA dostatečně kvalitní a je třeba vyžádat nový vzorek tkáně, případně provést biopsii dostupného metastatického ložiska. Z tohoto důvodu byla do logistiky vyšetřování genu KRAS zařazena možnost izolace a zjištění kvality nádorové DNA v předstihu před provedením vlastního vyšetření. Tato alternativa je ke zvážení především u pacientů po kurativní resekci kolorektálního karcinomu zatížených vysokým rizikem relapsu onemocnění – tedy klinické stadium III a stadia II „high risk“ podskupiny (32). Z výtěžné archivované DNA je pak možnost provést vyšetření ve velmi krátké době (obr. 3C).

ZÁVĚR

Testování mutací v kodonech 12 a 13 genu KRAS je dnes standardním postupem v léčebném algoritmu u pacientů s metastatickým kolorektálním karcinomem. V blízké budoucnosti se patrně ukáže, zda se pacienti s kolorektálním karcinomem budou pro predikci odpovědi na anti-EGFR terapii dále stratifikovat na základě přítomnosti mutace v genu BRAF, případně dosud rutině nevyšetřovaných oblastí genu KRAS s popsanými onkogenními mutacemi. Z hlediska pacienta je zásadní, aby vyšetření mohlo být a bylo provedeno správně v co možná nejkratším čase. Podstatnou roli hraje nejen analyticky kvalitní a standardizovaný postup molekulárního vyšetření (od izolace DNA po vlastní vyšetření), ale zásadně také pracoviště, které připravuje vzorek tkáně po kurativním chirurgickém zákroku, a standardizovaný postup hodnocení tkáně patologem. Laboratoř provádějící vyšetření by měla dosahovat vysoké úspěšnosti při extrakci nádorové DNA, volit robustní vyšetřovací metodu s dostatečnou citlivostí záchytu mutované DNA a správnost poskytovaných výsledků opírat o externí hodnocení kvality případně mezilaboratorní srovnání. 

Zkratky

ARMS           – amplification refractory mutation system

ASCO            – American Society of Clinical Oncology

ASO              – allele-specific oligonucleotide

CAP              – College of American Pathologists

CLIA             – Clinical Laboratory Improvement Amendments

DHPLC         – denaturing high performance liquid chromatography

EGFR            – epidermal growth factor receptor

FFPE             – formalin-fixed parafin-embedded

ESP               – European Society of Pathology

GAP              – GTPase activating protein

GEF               – guanine nucleotide exchange factor

HRMA           – high-resolution melting analysis

Ki-ras2          – Kirsten rat sarcoma virus oncogene homolog

NCCN           – National Comprehensive Cancer Network

POET           – Perspectives on Emerging Technologies

RFLP            – restriction fragment length polymorphism

TKI               – tyrosin kinase inhibitor

UK NEQAS   – United Kingdom National External Quality Assessment Service 

Práce vznikla za podpory výzkumného záměru FUNDIN MZMOU2005, Evropského fondu pro regionální rozvoj pro RECAMO (CZ.1.05/2.1.00/03.0101) a BIOMEDREG (CZ.1.05/2.100/01.0030), a MŠMT pro BBMRI_CZ (LM2010004).  

Adresa pro korespondenci:

RNDr. Lenka Dubská, PhD.

Oddělení laboratorní medicíny, Masarykův onkologický ústav

Žlutý kopec 7, 656 53 Brno

fax: +420 543 136 721, e-mail: dubska@mou.cz