Současné metody multiplexní imunohistochemie pro analýzu fixovaných tkáňových vzorků

Tkáňová diagnostika z formalínem fixovaných a parafinem zalitých preparátů (FFPE) je primárně založena na rutinním barvení hematoxylinem a eosinem (H&E), které je často doplňováno chromogenní imunohistochemií (IHC) za účelem detekce specifických antigenů in situ (1–3). Detekce proteinů je zásadní pro histopatologickou diagnostiku, objasnění patogeneze a patofyziologie onemocnění i rozhodování o léčbě (1). Metodika IHC zahrnuje několik základních kroků, a to přípravu tkáně, zhotovení parafinových řezů, odmaskování epitopu, blokování nespecifických vazeb, inkubaci imunoglobulinů a vizualizaci kýžených antigenů. Každý krok musí být pečlivě optimalizován pro zajištění přesných a reprodukovatelných výsledků (4).

Vizualizace může být chromogenní (enzym a chromogen) či imunofluorescenční (IF) (4). Obě metody lze provést přímým způsobem (jedna konjugovaná protilátka) nebo nepřímým (sekundární protilátka s konjugátem) (5), přičemž nepřímá metoda zvyšuje intenzitu signálu a citlivost (6,7). Chromogenní preparáty umožňují snadnou archivaci, opakovatelné pozorování pod světelným mikroskopem a jsou nákladově efektivnější (2,8). Oproti tomu IF značení nabízí vyšší citlivost, možnost modulace signálu fluoroforu a detekce širší škály exprimovaných proteinů současně (9).

Pro diagnostiku a cílenou léčbu často nestačí vyšetření pouze jediného proteinu (7). Konvenční IHC vyžaduje samostatné řezy pro každý antigen, což může vést k vyčerpání materiálu a znemožnění dalších analýz. Multiplexní imunohistochemie (mIHC) tento problém překonává. Umožňuje komplexní analýzu tkáně, zahrnující interakce buněk a proteinů i jejich prostorových uspořádání, což přispívá k hlubšímu pochopení patologických mechanismů. Zmíněná analýza je vhodná jak pro efektivní predikci odpovědi na léčbu, tak pro studium nádorového mikroprostředí (tzv. tumor microenviroment, TME) (10). Tento přehledový článek poskytuje ucelený přehled současného stavu aplikací a přístupů mIHC v oblasti molekulární patologie.

Obr. 1. Schéma jednorázového multiplexního značení pomocí platformy Orion. Emisní spektra fluoroforů jsou postupně rozlišována pomocí sedmi excitačních laserů a laditelných optických filtrů. Následně je možno stejný řez nabarvit H&E a doplnit sken v režimu brightfield. Převzato z (17).

Multiplexní chromogenní a imunofluorescenční imunohistochemie

Multiplexní IHC poskytuje komplexní analýzu tkání (7). Tato metoda je obzvláště cenná pro detailní analýzu imunitních a nádorových signálních drah včetně jejich prostorového uspořádání v rámci jediného FFPE řezu, což přispívá k přesnější klasifikaci pacientů pro imunoterapii a k identifikaci potenciálních biomarkerů pro predikci odpovědi na léčbu (11). Přesto implementace mIHC do rutinních klinických laboratoří je dosud omezená, a to zejména kvůli vyšším nákladům, delší době zpracování a potřebě specializovaných znalostí pro optimalizaci, validaci i digitální analýzy. V současnosti je k dispozici omezené množství validačních studií zaměřených na hodnocení diagnostické účinnosti platforem mIHC. Zároveň chybí schválené komerční farmaceutické aplikace (tzv. companion diagnostics, CDx) a mIHC technologie aktuálně nesplňují požadavky stanovené pro diagnostické testy in vitro (IVD) (12,13). Rovněž sférická překážka mezi jednotlivými protilátkami a antigeny může ovlivňovat detekci jednotlivých proteinů (2). Z těchto důvodů je pečlivá optimalizace a validace zásadní pro zajištění spolehlivosti a reprodukovatelnosti napříč laboratořemi (3).

Metoda mIHC je principiálně stejná jako konvenční IHC, avšak s tím hlavním rozdílem, že na jednom řezu je hodnoceno několik markerů současně (Obr. 1, Tab. 1, 2). Detekce antigenů u mIHC je stále umožněna enzymaticky nebo fluorescenčně (2,3,8). Pro chromogenní mIHC je poněkud limitující rozsah vlnových délek pohybující se pouze v oblasti viditelného spektra, a navíc i úzká škála dostupných činidel a chromogenů. Zmíněné nevýhody jsou schopny překonávat některé IF přístupy (14). IF multiplexování lze využít pro značení desítek až stovek biomarkerů. (15). Oproti klasické IHC však vyžaduje hodnocení jednotlivých biomarkerů pečlivé sladění vybraných protilátek a detekčních metod i pokročilou digitální analýzu obrazu pro smysluplnou interpretaci (14,16,17). K řešení těchto omezení byla vyvinuta řada pokročilých technik mIHC, které jsou komentovány v dalších kapitolách (2,18–25).

Sekvenční značení s opakovaným snímáním

Sekvenční značení využívá přístup cyklické mIHC, který sdílí klíčové principy s klasickou IHC. Tato metodika je rozšířena o postupy umožňující opakovanou aplikaci různých protilátek na tentýž tkáňový vzorek. Tento proces zahrnuje detekci antigenů, digitalizaci obrazu a případně odstranění krycího skla i chromogenního produktu či inaktivaci fluoroforu, v závislosti na použité metodě. Celý cyklus je následně opakován pro další antigeny. Výsledné digitální snímky jednotlivých cyklů jsou následně sloučeny do jednoho komplexního obrazu (18–23).

Na chromogenním podkladu je založena metoda multiplexního imunohistochemického konsekutivního barvení na jednom sklíčku (tzv. Multiplexed Immunohistochemical Consecutive Staining on Single Slide, MICSSS). Jedná se o odnož cyklické mIHC detekující až 10 biomarkerů na jediném tkáňovém řezu (18–20). MICSSS umožňuje značení jak membrán, tak i jader bez sterických překážek díky účinnému odbarvování a blokování protilátek mezi cykly. Pro efektivní odstranění chromogenů mezi jednotlivými cykly je nutné, aby byly vybrány pouze substráty rozpustné v organickém rozpouštědle (19). Ačkoli tato metoda přináší značné výhody pro současnou analýzu mnoha antigenů, včetně současného zpracování přibližně 30 preparátů, existují jistá omezení. Mezi ně patří potenciální poškození tkáně a snížení kvality obrazu v důsledku opakovaného zpracování (3,19). Tento přístup je také časově náročný, a to jak samotným barvením (každý cyklus trvá v průměru 6-7 hodin), tak i tvorbou panelu protilátek a chromogenů (18,19). Každý sledovaný protein musí být testován v různých pozicích v panelu, aby se ověřila jeho kompatibilita s ostatními markery a stabilita signálu při opakovaném zpracování tkáně. Pořadí značení má zásadní vliv na kvalitu a kvantifikaci výsledků, a proto je nezbytné provádět pravidelné revalidace panelů, zejména při změně nebo doplnění dalších vyšetřovaných proteinů (3).

Další technologií na bázi chromogenní mIHC je sekvenční imunoperoxidasové značení a odstraňování (tzv. Sequential Immunoperoxidase Labeling and Erasing, SIMPLE). Jedná se o nepřímou metodu s využitím peroxidázového substrátu 3-amino-9-ethylkarbazol (AEC) k vizualizaci proteinů. Metodika začíná rehydratací FFPE řezů, po níž následuje slabé obarvení jader hematoxylinem. Barvení je stabilizováno krátkou expozicí v alkalickém roztoku –⁠ nejčastěji zředěném NH₄OH. Po tomto kroku je preparát poprvé naskenován. Následuje aplikace protilátky a substrátu AEC. Po zachycení snímku je AEC alkoholem odstraněn a značení je vymyto oxidativním roztokem obsahujícím kyselý KMnO₄, což umožňuje další cyklus barvení. Výsledné snímky jsou analyzovány jednotlivě nebo digitálně sloučeny. Detekce je omezena na 12 biomarkerů, přičemž klíčovým limitujícím faktorem pro rozšíření panelu je pravděpodobně zhoršení fyzické integrity tkáně způsobené častou manipulací a opakovanými dehydratacemi vzorku (7,26).

Metoda vícenásobné epitopové ligandové kartografie (tzv. Multi-Epitope Ligand Cartography, MELC) umožňuje simultánní vizualizaci proteinové exprese za využití IF značení, přičemž fluorofor je po každém cyklu značení odstraněn řízeným fotovybělováním (15,27–30). Tento přístup spočívá v opakovaném cyklickém barvení protilátkami konjugovanými s fluorofory. Následuje snímání pomocí vysoce citlivé digitální kamery a odstranění signálu prostřednictvím světelné expozice. Tímto způsobem je umožněno další barvení a je tak možné detekovat desítky markerů na jednom řezu (12,28–31). Tento přístup byl dále rozvinut metodou Toponome Imaging System (TISTM), která umožnuje detekci až 100 markerů v jediné buňce (32). Výsledné snímky jsou poté překrývány pro analýzu koexprese. Nicméně snímání je z časových důvodů omezeno pouze na definované oblasti zájmu (ROI) u jednotlivých cyklů (12,28–31). MELC nemusí být optimální metodou pro analýzu tkáňových vzorků se zvýšenou autofluorescencí, což je zvláště problematické u některých archivních FFPE vzorků (31). Mezi další významné faktory také patří zvýšené náklady související s potřebou použití robotického invertovaného mikroskopu (15).

Na rozdíl od metody MELC, která je typicky omezena na snímání ROI, umožňuje metoda cyklické imunofluorescence (CycIF) snímání celých preparátů (7,28). Jedná se o metodu postupného cyklického značení, při němž jsou v každém cyklu aplikovány dvě až tři protilátky, které mohou být přímo nebo nepřímo konjugovány s různými fluorofory. Po každém kole značení jsou jednotlivé markery nasnímány. Fluorofory jsou před každým dalším cyklem chemicky nebo fotochemicky inaktivovány. Tímto přístupem lze detekovat více než 60 proteinů. Podobně jako u chromogenní cyklické mIHC, je zde stále časová náročnost při sestavování panelu, ale stejně tak i delší doba každého cyklu barvení (7,12,33–35).

Alternativou je technologie MACSima™ Imaging Cyclic Staining (MICS) od Miltenyi Biotec, která vykazuje vysokou citlivost a dynamický rozsah. Využití cyklického barvení umožňuje MICS dosáhnout lineárního dynamického rozsahu v pěti řádech. Tento systém je plně automatizovaný, zahrnuje robotickou manipulaci, automatické podávání reagencií a skener. Zobrazovací systém MACSima™ využívá cyklické imunofluorescenční barvení, promývání vzorku, širokoúhlé mikroskopické snímání a eliminaci signálů pomocí fotovybělování nebo uvolněním konjugátů specifickými činidly. Každý cyklus zahrnuje aplikaci tří fluoroforem značených protilátek. Metoda integruje pokročilé algoritmy pro zpracování obrazu, včetně korekce autofluorescence a zobrazování s vysokým dynamickým rozsahem, což zajišťuje přesnou prostorovou a fenotypovou charakterizaci buněk. Tento přístup umožňuje aplikaci více než 100 protilátek na jeden FFPE vzorek a zahrnuje knihovnu konjugátů pokrývajících 554 epitopů (36,37).

Další cyklickou metodou je COMET™ od firmy Lunaphore Technologies. Jedná se o plně automatizovanou platformu založenou na mikrofluidní technologii pracující s běžně dostupnými reagenciemi. Barvicí jednotka obsahuje mikrofluidní čip, který zkracuje inkubační dobu z více než 1 hodiny na méně než 5 minut. Čip je umístěn na sklíčku s tkání a společně vytváří reakční komoru, jejíž oblast je vymezena těsnicí vložkou a přitlačována pístem. Reagencie jsou v komoře cirkulovány přes vzorek, přičemž teplota je řízena Peltierovým článkem pod sklíčkem (38).

Tyramidová amplifikace signálu

Tyramidová amplifikace signálu (tzv. Tyramide Signal Amplification, TSA) představuje jednoduchou modifikaci konvenční nepřímé IHC. Místo 3,3'-diaminobenzidinu (DAB), jež bývá nejčastěji aplikován, se jako substrát pro enzym používají chromogeny či fluorofory navázané na tyramid (43,44). Enzym (nejčastěji křenová peroxidáza či alkalická fosfatáza) konjugovaný se sekundární protilátkou aktivuje tyramid, který se kovalentně váže i s detekční značkou na tyrozinové zbytky v bezprostřední blízkosti původního epitopu. Po odstranění komplexu primární a sekundární protilátky lze tento proces opakovat, přičemž výhodou je možnost použití protilátek ze stejného zvířecího zdroje. To umožňuje efektivní multiplexní detekci antigenů (Obr. 2) (15,28,45). Existují i další modifikace TSA, jež zahrnují tyramid konjugovaný s biotinem anebo dinitrofenylem. Jedná se o hapteny poskytující více vazebných míst pro následnou detekci pomocí streptavidinu či protilátek spojených s reportérovými molekulami, čímž přispívají ke zvýšení citlivosti metody (45). Amplifikační techniky jsou zejména cenné pro detekci slabých a těžce detekovatelných signálů, které je obtížné hodnotit pomocí klasických IHC, jako je například exprese arginázy-1 v makrofázích či PD-L1 u komplexních malignit (10,28,46).

TSA poskytuje lepší prostorové rozlišení než DAB nebo AEC, jelikož při jejich využití mohou reakční produkty difundovat mimo místa enzymové aktivity. Díky zvýšené citlivosti TSA lze snížit koncentraci primární protilátky dvakrát až padesátkrát oproti konvenční IHC, což vede k vysoce specifickému signálu s minimálním pozadím. To přispívá ke zlepšení poměru signálu k šumu, jasnějšímu zobrazení buněk a detekci subcelulárních struktur, které by jinak nebyly viditelné (45). Navíc tento přístup je nákladově srovnatelný s chromogenními IHC a umožňuje použití více druhově podobných primárních protilátek (15).

Obr. 2. Reprezentativní mikrofotografie vzorku B-lymfoblastické leukemie/lymfomu v kůži s multiplexním značením a tyramidovou amplifikací signálu. Detekce byla provedena pomocí fluoroforů Opal™ (Akoya Biosciences): Opal 520 (zeleně; TdT, polyklonální protilátka, Roche), Opal 570 (žlutě; CD79α, klon JCB117, Dako) a Opal 690 (červeně; CD3 klon 2GV6, Roche). Buněčná jádra byla obarvena DAPI (tmavě modrá). Snímky byly pořízeny pomocí skeneru Olympus VS200 za použití světelného zdroje X-Cite XYLIS II (Excelitas Technologies). Měřítko odpovídá 20 μm.

Obr. 3. Reprezentativní mikrofotografie vzorku kolorektálního karcinomu získaná multiplexní imunohistochemií na platformě Orion. Značení bylo provedeno pomocí fluoroforem konjugovaných primárních protilátek (RareCyte): anti-human FAP (EPR20021) konjugovaná s ArgoFluor™ 602 (tmavě zelená), anti-human CD3ε (D7A6E) s ArgoFluor™ 686 (bílá), anti-human E-cadherin (4A2) s ArgoFluor™ 730 (růžová), anti-human CD163 (EPR14643) s ArgoFluor™ 760 (červená), anti-human GLUT1 (EPR3915) s ArgoFluor™ 580L (zelená) anti-human CD8α (AMC908) s ArgoFluor™ 624 (bílá) a anti-human FOXP3 (236A/E7) detekovaná pomocí digoxigeninem značené protilátky a sekundární protilátky mouse-anti-digoxin (HY-A.1) konjugované s ArgoFluor™ 784 (žlutá). Buněčná jádra byla obarvena Hoechst barvivem (tmavě modrá). Snímky byly pořízeny pomocí skeneru Orion (Rarecyte). Měřítko odpovídá 20 μm.

Využití IF značení pro mIHC s sebou nese také některá úskalí. Existuje totiž riziko tzv. deštníkového efektu způsobeného nadměrným působením tyramidu (10). Označuje se tak jev, při kterém přítomnost dříve naneseného markeru na tkáňovém řezu brání aplikaci dalšího markeru, který se s ním prostorově překrývá, což může vést ke zkreslení výsledků při detekci více biomarkerů ve stejném buněčném kompartmentu (47). To vyžaduje důkladné hodnocení jednotlivých markerů během optimalizace, detailní analýzu pozitivních a negativních kontrol a zároveň pokročilou digitální analýzu. Dalším omezením je počet protilátek v panelu, který je limitován spektrálním překryvem fluoroforů (10). IF metoda TSA, známá pod pojmem Opal od výrobce Akoya Biosciences, umožňuje multiplexní detekci až 9 různých biomarkerů v jednom panelu, přičemž tkáň lze analyzovat v rámci jediného snímacího cyklu. (2,10,24,25,47).

Optimalizované chromogeny pro mIHC oproti tradičním chromogenům, jež mají tendenci se nasytit a neumožňují překrývání, dokážou generovat třetí barvu, čímž jsou schopné detekce 4 až 5 markerů na jednom preparátu (např. od firmy Roche). Zároveň touto technikou lze snadno zobrazit jednotlivé markery pomocí světelného mikroskopu, avšak jejím omezením nadále zůstává úzký dynamický rozsah a spektrální překrývání signálu (2,8).

Protilátky konjugované s DNA značkami

Protilátky konjugované s DNA představují efektivní přístup multiplexování díky nukleotidové specificitě. Tento koncept vedl k rozvoji metod např. kódování pomocí indexování (tzv. CO-Detection by indEXing, CODEX) (48,49), imunohybridizační řetězové reakce (tzv. Immuno-Hybridization Chain Reaction, Immuno-HCR) (50,51), výměnného zobrazování DNA (tzv. DNA Exchange Imaging, DEI) (52), imunobarvení se zesílením signálu výměnnou reakcí (tzv. Immunostaining with Signal Amplification By Exchange Reaction, Immuno-SABER) (53), InSituPlex® (54), SignalStar™ (55) či digitálního prostorového profilování (tzv. Digital Spatial Profiling, DSP) (56). Tyto metody z principu kombinují imunobarvení s imunoglobuliny konjugovanými se specifickými oligonukleotidy a hybridizaci komplementárních DNA sekvencí navázaných na fluorofory. Po nabarvení tkáňového řezu směsí několika DNA-kódovaných protilátek dochází v jednotlivých cyklech k hybridizaci vybraných komplementárních sond, jejich fluorescenční detekci a následnému vymytí před dalším cyklem. V každém cyklu je obvykle zahrnuto i jaderné barvení (např. DAPI nebo Hoechst) umožňující přesné překrytí jednotlivých snímků (48–50,52,53,57). DSP využívá alternativní přístup detekce, a proto se v některých klíčových aspektech metodicky liší od výše uvedených technik (56).

Na rozdíl od některých jiných multiplexních metod postrádají DEI a CODEX mechanismus amplifikace signálu, což může negativně ovlivnit citlivost detekce, a to zejména u slabě exprimovaných epitopů (49,52). Oproti tomu Immuno-SABER tento nedostatek kompenzuje využitím dlouhých oligonukleotidových DNA řetězců pro zesílení signálu. Tyto prodloužené oligonukleotidové řetězce však často obtížně pronikají do kompaktnějších či silnějších tkáňových vzorků, což omezuje maximální tloušťku vzorku vhodného pro analýzu (53). Immuno-HCR je izotermní neenzymatická metoda pro in situ amplifikaci signálu, při které se po navázání DNA-konjugované protilátky spustí polymerizační reakce fluorescenčně značených DNA vlásenek iniciovaných specifickou sekvencí. Tento přístup umožňuje multiplexní detekci vícero epitopů současně prostřednictvím unikátních iniciačních sekvencí pro každou protilátku (51). V porovnání s Immuno-SABER využívá tento přístup kratší nukleotidové sekvence, které snadno pronikají do tkání (50). Amplifikaci signálu využívají i robustní technologie, jako jsou InSituPlex® nebo SignalStar™, nicméně jejich multiplexní kapacita je omezena na detekci maximálně 12 epitopů na témž preparátu (54, 55).

Metoda DSP od společnosti NanoString využívá oligonukleotidové značky navázané na protilátky nebo RNA sondy prostřednictvím UV-fotoštěpitelných linkerů. Současně s tímto analytickým panelem jsou na stejný řez aplikovány také fluorescenčně značené protilátky, které slouží výhradně k vizualizaci morfologie tkáně a umožňují přesné určení ROI. Po digitálním zobrazení tkáňového řezu na základě signálu z těchto IF markerů jsou definované ROI selektivně ozářeny UV světlem, což vede k uvolnění indexovaných oligonukleotidů z analytických sond.

Uvolněné oligonukleotidy jsou následně zachyceny a kvantifikovány pomocí systému nCounter® nebo NGS, čímž je umožněna multiplexní analýza ve více ROI v průběhu 1,5 až 2,5 dne (56,58). Přestože DSP nezachycuje celý řez, umožňuje prostorové zobrazení dat z ROI, typicky ve formě heatmap. Při snaze o plošné pokrytí celého řezu velmi malými ROI však náklady na dosažení vysokého rozlišení neúnosně stoupají (3).

Využití hmotnostní spektrometrie

Přístupy mIHC zahrnují i metody založené na hmotnostní cytometrii, jako je CyTOF (Cytometry by Time Of Flight). Namísto fluoroforů či chromogenů jsou protilátky značeny stabilními izotopy kovů, jež lze snadno rozlišit na základě poměru hmotnosti iontů k jeho náboji (m/z). Pomocí laseru nebo iontového paprsku dochází k postupné ablaci značené tkáně. Po rozprášení s následnou ionizací jsou jednotlivé izotopy analyzovány hmotnostní spektrometrií (MS), což umožňuje přesnou identifikaci a kvantifikaci jednotlivých značených protilátek. Výsledkem je detailní mapa distribuce proteinů v tkáni s vysokým prostorovým rozlišením (7,16,59,60). Metoda CyTOF byla základním pilířem pro vývoj dalších metod jako je zobrazovací hmotnostní cytometrie (tzv.Imaging Mass Cytometry, IMC) (61) či multiplexní zobrazování iontovým svazkem (tzv. Multiplexed Ion Beam Imaging, MIBI).

Metoda IMC využívá laserový ablační systém s vysokým rozlišením, který umožňuje odpařování tkáňových vzorků s následným přenosem iontů do CyTOF pro detekci kovových izotopů. Tento přístup umožňuje dosáhnout rozlišení až na subcelulární úrovni, což přispívá k detailnímu popisu prostorové exprese proteinů a buněčných interakcí v tkáních. To umožnuje hluboké poznání tkáňové a nádorové biologie. I přes nesčetné množství výhod IMC sahající od schopnosti detekce mnoha proteinů, eliminace autofluorescence, vyšší komplexity dat až po vysokou kvantitativní přesnost analýzy, existují také některé limitace. Mezi ně patří omezené pokrytí a zobrazení oblasti tkání, nižší rychlost snímání obrazu, nedostatek zesílení signálu a zvýšené pořizovací a provozní náklady (7,61). MIBI je založena na přístupu hmotnostní spektrometrie sekundárních iontů. Po aplikaci konjugovaných protilátek a vysušení vzorku se povrch preparátu skenuje svazkem primárních iontů (např. O₂), čímž se uvolňují izotopové reportéry specifické pro protilátky vázané na povrchu vzorku jako sekundární ionty. Konjugáty jsou poté kvantifikovány opakovaným skenováním stejného zorného pole, přičemž každým skenem je možná detekce až sedmi izotopových reportérů (62). Obě tyto technologie umožňují současně zobrazit přítomnost, množství, umístění a funkční stav desítek až stovek biomarkerů (61,62). Tento postup předpokládá, že pro všechny cíle bude dostačující jednotný protokol pro odhalení antigenu, což nemusí platit pro každý panel (16).

Tabulka č. 1. Srovnání vybraných sekvenčních metod multiplexní analýzy FFPE tkáňových vzorků.

Tabulka č. 2. Srovnání vybraných metod multiplexní analýzy FFPE tkáňových vzorků na bázi TSA, hmotnostní cytometrie a DNA kódování.

Simultánní značení s jednorázovým snímáním

Simultánní aplikace všech protilátek zvoleného panelu s následným jednorázovým snímáním značené tkáně významně redukuje časovou náročnost a zároveň usnadňuje digitální analýzu (17,37). Jednou z těchto pokročilých platforem je systém Orion™ od společnosti RareCyte, jenž významně rozšiřuje možnosti mIHC analýzy FFPE tkání prostřednictvím simultánního multispektrálního snímání až ve 20 fluorescenčních kanálech (včetně detekce DNA a autofluorescenčních signálů). Platforma umožňuje současnou detekci všech biomarkerů v rámci jednoho barvicího cyklu, což přispívá k detailní fenotypizaci imunitních a nádorových populací, identifikaci strukturálních komponent mikroprostředí a analýze terapeutických mechanismů (Obr. 1, 3). Významnou výhodou této technologie je také schopnost kombinovaného zobrazení IF signálů a barvení H&E na témž řezu, čímž lze dosáhnout detailní analýzy proteinové exprese v kontextu buněčné morfologie a tkáňové architektury. Důležitým aspektem z pohledu klinického výzkumu a diagnostické praxe je rovněž možnost celoplošného snímání tkáně, které je nezbytné jak pro dosažení statisticky robustních závěrů, tak pro naplnění regulatorních požadavků (17,37).

Digitální obrazová analýza

Současné softwarové nástroje pro analýzu digitálních histopatologických obrazů většinou sdílejí podobné pracovní postupy. Klíčovým prvkem je využití referenčních bodů k identifikaci tkáňových struktur, což umožňuje segmentaci a klasifikaci obrazu i následnou detekci proteinů v různých tkáňových kompartmentech (75). Kvantifikace morfologie a exprese biomarkerů je zásadní pro přesnou klasifikaci tkání a buněk, které se dále hodnotí podle atributů specifických pro jednotlivé buňky. Buňky jsou následně klasifikovány jako pozitivní nebo negativní vůči jednotlivým markerům prostřednictvím binárních schémat (76).

Algoritmy strojového učení a automatizované modely hlubokého učení výrazně usnadňují analýzu velkých datových souborů, zejména pokud jsou schopny se adaptovat na tkáňovou heterogenitu (56,75,77). Nicméně jejich výkon může být nekonzistentní napříč různými snímky, pokud jsou použity pevně nastavené vstupní parametry, což představuje překážku pro zajištění robustní analýzy (76). Z tohoto důvodu se klade důraz na vytváření rozsáhlých tréninkových souborů obsahujících kvalitně anotovaná data. Avšak soubory dat obsahující anotace s důkladně ověřenou kvalitou jsou zřídkakdy publikovány. Přesto se v poslední době objevují studie, které se cíleně snaží tuto mezeru v oblasti zpřístupnění kvalitních tréninkových dat vyplnit (78).

Standardní pracovní postup pro multiplexní analýzu zahrnuje segmentaci tkáně a buněk, fenotypizaci a export dat pro další zpracování. Tkáňová segmentace je jedním z klíčových kroků analýzy digitálních obrazů, jejímž cílem je rozdělit obraz do biologicky významných kompartmentů, jako je nádor, stroma, cévy či jiné histomorfologické oblasti. Pro úspěšnou segmentaci je zásadní poskytování reprezentativních příkladů jednotlivých kategorií, přičemž kvalita těchto tréninkových oblastí přímo ovlivňuje výslednou přesnost algoritmu. Také je důležité eliminovat rušivé prvky, konkrétně artefakty barvení a zpracování tkáně nebo nekrózy. Tímto procesem se optimalizuje výkon softwaru za současné časové úspory (76). Pro segmentaci buněk se využívá kontrastního barvení, které umožňuje přesnou identifikaci a fenotypizaci jednotlivých buněk na základě lokalizace exprese v jejich specifických kompartmentech (tj. jádro, cytoplazma nebo membrána). Pro zlepšení přesnosti segmentace je vhodné zařadit jeden či více univerzálních markerů (např. cytokeratin, CD3, CD68) (79). Poté pomocí kombinace exprese jednotlivých nebo společných proteinů je možné definovat buněčné fenotypy a jejich funkční vlastnosti (76,79).

Jedním ze softwarů, který umožnuje analýzu digitálních obrazů je „open-source“ QuPath, jenž je navržený primárně pro zpracování a analýzu patologických snímků ve vysokém rozlišení. Nabízí široké možnosti anotace, segmentace a kvantifikace tkání, buněk a proteinů. Díky podpoře skriptování je vysoce přizpůsobitelný pro různé aplikace v patologii i výzkumu (80). ImageJ/Fiji je další univerzální nástroj s širokým spektrem funkcí pro základní, ale i pokročilé zpracování a kvantifikaci obrazů, zejména díky otevřené struktuře umožňující integraci„plug-ins“. Oproti QuPath však vyžaduje větší míru manuálního zásahu při analýze (81–83). QuPath navíc umožňuje snadný export obrazových dat do ImageJ/Fiji, což usnadňuje kombinované využití těchto nástrojů v rámci analýzy biologických snímků (80). HistoCAT (tzv. Histology Topography Cytometry Analysis Toolbox) je specificky navržen pro prostorovou analýzu a fenotypizaci buněk z hmotnostní cytometrie, což z něj činí ideální nástroj pro zkoumání komplexních buněčných interakcí, avšak jeho využití mimo hmotnostní cytometrii je omezenější ve srovnání s výše zmiňovanými platformami (80,83,84). Dalším "open source" přístupem je MCMICRO (tzv. Multiple Choice MICROscopy), který se zaměřuje na převod vícekanálových celoplošných snímků na jednobuněčná data (85,86). Kromě„open-source“ programů pro digitální patologii jsou k dispozici i komerční platformy, často dodávané s dedikovaným přístrojem, např. HALO (87,88), Definiens Tissue Studio (89), Aiforia (90), uPath aj. (91) (Tab. 3).

Perspektiva multiplexní imunohistochemie v klinických laboratořích

Metody mIHC představují slibný nástroj pro klinickou diagnostiku, hodnocení agresivity onemocnění i výběr terapie, avšak zatím zůstávají v raných fázích implementace (Obr. 2). I přes očekávaný nárůst významu mIHC v budoucnosti je nepravděpodobné, že by nahradila tradiční IHC v krátkodobém horizontu (2).

V rutinní patologické praxi se již řadu let využívají různé formy duálního IHC značení. Zpravidla jsou založeny na vizualizaci běžně dostupnými chromogeny DAB a AEC. Mnohé komerčně dostupné kombinace jsou již zavedeny jako IVD. Typickým příkladem je současná detekce p63 a AMACR, která se využívá při diagnostice nejednoznačných případů karcinomu prostaty (98,99). Obdobně se hodnotí exprese lehkých řetězců kappa a lambda k posouzení klonality při diagnostice mnohočetného myelomu. V diferenciálně-diagnostické rozvaze karcinomů dutiny břišní se často uplatňuje kombinace markerů CDX2 a CK7, zatímco v případě potvrzení diagnózy plicního adenokarcinomu se běžně používá souběžná detekce TTF1 a napsinu A. Rovněž u hematologických malignit je běžné paralelní značení jako CD4/CD8, Bcl2/Bcl-6, CD23/CD5, PAX5/CD5 nebo cyklin D1/CD79a aj.(100). V některých případech se využívají koktejly protilátek v kombinaci s dalším značením, například směs melanomových markerů detekovaná jedním chromogenem a proliferační marker Ki-67 druhým. Při použití pouze dvou chromogenů lze rovněž využít rozdíly v subcelulární lokalizaci některých proteinů. Příkladem jsou v cytoplazmě obsažené cytokeratiny, které mohou být vizualizovány stejným chromogenem jako zpravidla jaderný transkripční faktor p63, a to při zachování dostatečné rozlišitelnosti obou signálů. Díky pečlivé rozvaze založené na detailní znalosti antigenů je tak možné pomocí dvou chromogenů analyzovat expresi tří, ba dokonce čtyř proteinů. V žádném z těchto případů ovšem nelze mluvit o skutečně multiplexním značení (2).

V oblasti výzkumu je nadále preferovanou mIHC metodou IF značení kvůli své schopnosti detekovat vzácné buněčné populace nebo kolokalizace proteinů. Navzdory těmto výhodám je obtížné tuto metodu využívat rutinně, zejména kvůli reprodukovatelnosti signálů, a to i při zavedení automatizovaných postupů barvení (11). Pro IF multiplexní analýzu je nezbytná investice do specializovaného vybavení, zejména do multispektrálních skenerů. Navíc implementace těchto technologií rovněž klade nároky na dodatečné vzdělávání patologů i laboratorního personálu. Kromě toho by tak vzrůstala časová i finanční náročnost spojená s validací testů v porovnání s konvenční IHC (2). Navzdory těmto výzvám se někteří výzkumníci snaží být o krok blíže k integraci mIHC do rutinních klinických laboratoří. Například byla zkoumána reprodukovatelnost a klinická validace panelu šesti biomarkerů PD-L1, PD-1, CD8, CD68, FOXP3 a CK na vzorcích tonzily, karcinomu prsu a nemalobuněčného karcinomu plic napříč šesti institucemi. Plná validace tohoto panelu by mohla otevřít cestu i pro jeho klinické využití (101).

Tabulka č. 3. Přehled vybraných analytických softwarů určených pro zpracování digitálních obrazů v oblasti výzkumu a klinické diagnostiky.

I přes četné výhody nových sofistikovaných přístupů hmotnostní cytometrie a DNA kódování pro multiplexování, které umožňují detekci více než 100 biomarkerů na jediném vzorku, jsou zde značné překážky pro klinické použití. A to zejména časová náročnost, vybavení a náklady na analýzu. Heterogenita nádorů navíc komplikuje studium charakteristik nádorového mikroprostředí, protože většina těchto moderních metod analyzuje pouze část tkáně a neumožňuje celoplošnou analýzu. Zároveň se pro klinické zkoumání preferují techniky, jež nabízí rychlou, spolehlivou a nákladově efektivní analýzu heterogenní tkáně. Z těchto důvodů neustále vznikají nové techniky mIHC, jež se snaží zkrátit čas potřebný k analýze (např. Orion™ od Rarecyte) (17,37,102).

Dle dostupných informací nejsou mIHC pro analýzu mnohočetných markerů schválené v režimu IVD ani Evropskou agenturou pro léčivé přípravky (EMA), ani Úřadem pro kontrolu potravin a léčiv (FDA). Tyto metody proto nadále spadají do kategorie interně vyvinutých laboratorních testů. V důsledku toho jsou klinické laboratoře při jejich zavádění povinny validovat klíčové parametry, jako jsou přesnost, preciznost, kalibrační a kontrolní postupy, měřicí rozsah a referenční rozmezí. Veškeré tyto charakteristiky musí být řádně zdokumentovány (2,103).

ZÁVĚR

Možnost simultánní detekce více epitopů umožňuje detailní charakterizaci fenotypu a funkčního stavu buněk v tkáňovém mikroprostředí, což překonává omezení konvenční IHC. Zatímco chromogenní mIHC zůstává vhodná pro nízký stupeň multiplexování, fluorescenční a hmotnostně spektrometrické metody umožňují analýzu rozsáhlých panelů biomarkerů. Pro zvýšení specificity značení a usnadnění kvantifikace signálu lze použít protilátky konjugované s DNA značkami. Dynamický vývoj těchto technologií neustále rozšiřuje možnosti prostorové analýzy a přispívá ke zdokonalování stávajících přístupů. Nicméně jejich implementace do klinických laboratoří naráží na řadu výzev, včetně nutnosti validace protilátek, standardizace obrazové analýzy a regulatorních omezení souvisejících s interně vyvinutými laboratorními testy. Kromě toho je klíčové posouzení ekonomické stránky těchto metod v rutinní diagnostice. S postupující automatizací a digitalizací patologických procesů lze očekávat postupné začlenění mIHC do klinické praxe, což by mohlo významně přispět k přesnější stratifikaci pacientů a podpořit tak rozvoj personalizované medicíny.