Průtoková cytometrie a její využití

Součástí tohoto čísla Časopisu lékařů českých jsou zpráva a souhrny z konference „Analytická cytometrie V“, která se ve dnech 5.–8. září 2009 konala v Olomouci v Uměleckém centru Univerzity Palackého a byla zaměřena na problematiku metod optického vyšetřování buněk, zvláště pak průtokové cytometrie.

Průtoková cytometrie je laboratorní metoda umožňující měření fyzikálních a chemických vlastností buňky při průchodu laserovým paprskem. V současné době je to standardní metoda k analýze buněk (částic) v suspenzi. Tato metoda nalezla největší uplatnění v medicíně a v biologii. Významná část klinických aplikací je založena na tzv. imunofenotypizaci, průkazu antigenů –⁠ (CD znaků –⁠ cluster of differentiation), které charakterizují jednotlivé buněčné subpopulace. Principem je reakce antigen-protilátka a vizualizace protilátky značením pomocí barviva –⁠ fluoroforem. Z dalších klinicky významných aplikací je to měření obsahu DNA v buňkách (cytometrická DNA analýza umožňující hodnocení ploidie a kinetiky buněčného cyklu), stanovení koncentrace a aktivity některých enzymů v buňkách, hodnocení vnitřního prostředí buněk (pH, hladiny intracelulárního kalcia), posuzování průniku některých léků do buněk (adriamycin, ellipticin), průkaz fetomaternální transfuze, kontrola transfuzních přípravků (kontaminace leukocyty) a měření retikulocytů. V oblasti alergologie metoda umožňuje vyšetřování přecitlivělosti na antibiotika, potraviny a hmyzí jedy. K dalším aplikacím patří průkaz HLA-B27 antigenu u revmatických chorob, vyšetření LDL receptorů na monocytech u familiární hypercholesterolémie, stanovení autoprotilátek proti trombocytům a proti HLA antigenům v transplantační medicíně. V současnosti jsou již dostupné metody multiplexové analýzy umožňující současné měření mnoha sérových proteinů. Výhodou takového přístupu je úspora biologického materiálu, úspora časová i finanční. Vyšetření průtokovým cytometrem je rutinní součástí sledování pacientů s AIDS, kdy počet CD4⁺ lymfocytů je základním parametrem pro sledování aktivity onemocnění. Průtokové cytometrie se využívá pro stanovení diagnózy leukémií, lymfomů a některých dalších zhoubných nádorů. Následná terapie těchto onemocnění vychází z přesného imunologického zařazení leukémie nebo lymfomu, které umožňuje nejvhodnější léčebný postup. Metody se využívá ke sledování účinků imunosupresivní léčby po transplantacích solidních orgánů nebo u imunoterapie nádorů.

Velice rozsáhlé je spektrum metodik využitelných v biomedicínském výzkumu. Tam je cytometrie kromě výše uvedených metod často využívána pro detekci různých typů buněčné smrti a viability buněk, měření membránových potenciálů, hodnocení buněčných lipidů, stanovení reaktivních kyslíkových radikálů apod. Průtoková cytometrie slouží k hodnocení funkce lymfocytů (test blastické transformace, produkce cytokinů po stimulaci), granulocytů a monocytů (fagocytární aktivita, produkce kyslíkových radikálů aj.) i NK buněk (cytotoxicita).

Metoda nachází uplatnění i v jiných oborech, než je medicína, například v biologickém výzkumu půdních mikroorganismů, mořského planktonu či rostlin. Pomáhá zde genetikům, fyziologům, šlechtitelům nebo evolučním biologům. Jedním z průkopníků těchto technik v rostlinné biologii je předseda České společnosti pro analytickou cytologii a předseda organizačního výboru konference doc. ing. Jaroslav Doležel, DrSc. z Ústavu experimentální botaniky Akademie věd České republiky. Ve svém výzkumu využívá cytometrii k analýze a sortování rostlinných chromosomů.

K dalším metodám analytické cytologie patří čipy pro analýzu RNA (expresní čipy) nebo DNA (CGH mikroarray), digitální a konfokální mikroskopie a příbuzné moderní technologie. Tyto, v současnosti velmi intenzivně rozvíjené metody mají své uplatnění dosud převážně ve výzkumu. Lze však předpokládat, že v dohledné době naleznou své místo i v klinické diagnostice.

Souhrny uvedené v tomto čísle Časopisu lékařů českých vám umožní seznámit se s možnostmi těchto metodik a s dalším směrováním klinických a výzkumných aplikací.

Adresy pro korespondenci:

prof. MUDr. Tomáš Eckschlager, CSc.

Klinika dětské hematologie a onkologie 2. LF UK a FNM

V Úvalu 84, 150 06 Praha 5

e-mail: tomas.eckschlager@lfmotol.cuni.cz

MUDr. Miroslav Průcha, Ph.D.

Oddělení klinické biochemie, hematologie a imunologie Nemocnice Na Homolce

Roentgenova 2, 150 30 Praha 5

e-mail: miroslav.prucha@homolka.cz