XIX. Hereditární nádorové syndromy

4. VÝVOJ GENETICKÉHO TESTOVÁNÍ NA MOÚ OD ZAČÁTKŮ 1997 PO SOUČASNOST

MACHÁČKOVÁ E., VAŠÍČKOVÁ P., HÁZOVÁ J., PAVLŮ H., MIŠOVE A., NOVÁKOVÁ K., NAVRÁTILOVÁ M., GRELL R., VALÍČKOVÁ A., FORETOVÁ L.

Centrum lékařské genetiky, MOÚ Brno

Počátky genetické konzultace u hereditárních nádorových syndromů v MOÚ sahají do roku 1997 s nástupem Lenky Foretové, která si přivezla zkušenosti z Dana-Farber Cancer Institute v Bostonu a v roce 1998 podala grant na vyšetření genů BRCA genů u syndromu dědičné predispozice nádorů prsu a ovaria, což umožnilo vznik molekulárně-genetické laboratoře v roce 1999. Až s odstupem několika let byly schváleny úhrady genetických vyšetření u dědičných nádorových syndromů. Na zavedení indikačních kritérií v ČR jsme se aktivně podíleli tvorbou supplement Klinické onkologie: Hereditární nádorová onemocnění I.–V. (2006–2019) i vydáním knihy Hereditární nádorová onemocnění v klinické praxi (Foretová a kol., Grada 2022). Od počátečních vyšetření heteroduplexní analýzou a Protein Truncation testem s následným sekvenováním na gelovém Alf-express sekvenátoru bylo možné s novým zařízením od roku 2007 přejít na senzitivnější vysokorozlišovací analýzu křivek tání, 4kapilární 3130 sekvenátor a doplnění diagnostiky o MLPA analýzu. Urychlení a zpřesnění analýz spolu s personálním navýšením nám umožnilo rozšíření diagnostiky o Lynchův syndrom, Li-Fraumeni a vyšetření dalších predispozičních genů: CDH1, CDKN2A, CHEK2, PDGFRA a KIT u GIST diagnóz a později PALB2 a GAPPS syndrom. Od roku 2014 bylo zařazeno sekvenování nové generace: nejdříve TruSight Hereditary Cancer panel –⁠ 96 genů, pak vlastní MMCI panel 54 genů. Díky společným grantovým projektům s UBLG 1. LF bylo od roku 2016 zavedeno vyšetření panelem CZECANCA > 200 genů. Pořízení bioinformatického analyzátoru FinalistDX v roce 2017 vedlo k nezávislosti na externích bioinformatických službách. Od roku 2018 vešel v platnost kód pro NGS úhradu: Hereditární nádorové syndromy, a tím byla většinová diagnostika převedena na NGS, ale původní metody jsou stále využívány pro prediktivní vyšetření nádorové predispozice v rodinách s identifikovanou rizikovou mutací. Molekulární genetika je rychle se rozvíjejícím diagnostickým oborem. Podpora granty MZ ČR nám usnadnila inovace a validace nových postupů vyšetření před zavedením do rutinní diagnostiky. Naše výsledky nám umožnily zapojení do mezinárodních projektů IARC, IBCCS nebo ENIGMA Consortium (Evidence-Based Network for the Interpretation of Germline Mutant Alleles), o čemž svědčí spoluautorství v řadě významných mezinárodních publikací. Od roku 2021 jsme členy ERN GENTURIS (European Reference Network on Genetic Tumour Risk Syndromes).

Podpořeno z programového projektu Ministerstva zdravotnictví ČR s reg. č. AZV NU23-03-00150; ERN GENTURIS.

5. MOŽNOSTI PERSONALIZOVANÉ LÉČBY U VYBRANÝCH DĚDIČNÝCH NÁDOROVÝCH SYNDROMŮ

GRELL P.¹, GRELL R.², NOVÁKOVÁ K.²

¹ Klinika komplexní onkologické péče, MOÚ Brno, ² Centrum lékařské genetiky, MOÚ Brno

Management pacientů s hereditárními nádorovými syndromy prochází zásadním paradigmatickým posunem, při němž se primární fokus přesouvá od pouhé familiární surveillance a včasné detekce malignit k cílené terapeutické intervenci využívající specifické molekulární alterace v zárodečné linii. Precizní onkologie otevírá spektrum možností personalizované léčby, která reflektuje hlubší porozumění patofyziologickým mechanizmům, zejména defektům v systémech opravy poškozené DNA a specifickým buněčným signálním drahám. Klasickým příkladem je deficit homologní rekombinace (HRD) vyvolaný zárodečnými patogenními variantami v genech BRCA1/2 a dalších genech komplexu HRR. Koncept syntetické letality je dosažen nasazením inhibitorů PARP (PARPi), již pevně integroval personalizovaný přístup do standardních algoritmů léčby karcinomu ovarií, prsu, pankreatu a prostaty. Paralelně s tím představuje syndrom Lynch (HNPCC), charakterizovaný defektem mismatch repair systému (dMMR) a následnou mikrosatelitovou instabilitou (MSI-H), modelový příklad pro vysoce efektivní terapii pomocí checkpoint inhibitorů. Imunoterapie u těchto pacientů dosahuje dramatických efektů a dlouhodobé léčebné odpovědi napříč různými histologickými typy solidních nádorů. Rozšiřující se portfolio personalizované medicíny zasahuje i vzácnější syndromy: příkladem je využití vysoce selektivních inhibitorů RET u syndromu mnohočetné endokrinní neoplazie typu 2 (MEN2), nasazení inhibitorů mTOR u komplexu tuberózní sklerózy či cílená terapie inhibitorem HIF-2alfa (belzutifan) u von Hippel-Lindau (VHL) syndromu, která demonstruje schopnost systémové léčby redukovat tumorózní nálož a oddálit nutnost opakovaných chirurgických intervencí. Zcela novým potenciálním směrem v této oblasti mohou být vakcíny cílené na neoantigeny. Tento inovativní imunoterapeutický přístup může najít své uplatnění jak v terapeutické oblasti u již rozvinutých malignit, tak i v prevenci vzniku atypických buněk (imunoprevence) nebo k zastavení přeměny prekanceróz v malignitu (intercepce). Zásadní klinickou výzvou zůstává včasná a přesná identifikace nosičů těchto syndromů a efektivní integrace těchto dat v rámci multidisciplinárního přístupu. Personalizovaná léčba vybraných dědičných syndromů již nepředstavuje pouze alternativní možnost při vyčerpání standardních linií, ale stává se integrální součástí primárního léčebného plánu s prokazatelným dopadem na prodloužení přežití a zachování kvality života pacientů.

6. KOMPLEXNÍ MANAGEMENT LYNCHOVA SYNDROMU Z POHLEDU ONKOLOGA: KLINICKÉ ZKUŠENOSTI

HALÁMKOVÁ J.

Klinika komplexní onkologické péče, MOÚ Brno

Lynchův syndrom představuje nejčastější hereditární syndrom predisponující ke vzniku kolorektálního karcinomu i dalších malignit. Včasná identifikace nosičů patogenních variant genů mismatch repair systému má zásadní význam pro efektivní prevenci, časný záchyt nádorových onemocnění i individualizaci léčebných postupů. Přednáška nabídne pohled onkologa na komplexní management pacientů s Lynchovým syndromem v běžné klinické praxi. Diskutovány budou také praktické aspekty dlouhodobého sledování těchto pacientů. Přednáška představí klinické zkušenosti ilustrující přínos koordinované péče a personalizovaného přístupu v managementu Lynchova syndromu se zaměřením na zachování dobré kvality života.

8. KARCINOM PROSTATY, GENETICKÉ TESTOVÁNÍ A MOŽNOSTI PERSONALIZOVANÉ TERAPIE

NAVRÁTIL J.¹, HÁZOVÁ J.², VAŠÍČKOVÁ P.², NAVRÁTILOVÁ M.², FORETOVÁ L.²

¹ Klinika komplexní onkologické péče, MOÚ Brno, ² Oddělení gynekologické onkologie, MOÚ Brno

Karcinom prostaty patří mezi nejčastější nádorová onemocnění u mužů a jeho incidence celosvětově i v České republice nadále narůstá. V posledních letech se ukazuje, že až 30 % nádorů je podmíněna genetickými změnami, zejména mutacemi v genech zapojených do homologní rekombinační reparace DNA (HRR), mezi které patří především geny BRCA1, BRCA2 a další. Nádory nesoucí HRR mutace se vyznačují vyšší agresivitou, rychlejší progresí a často také nižší odpovědí na konvenční terapeutické postupy, včetně hormonální léčby či chemoterapie. Znalost mutačního statusu proto hraje klíčovou roli nejen při odhadu prognózy, ale především při rozhodování o optimální léčebné strategii. Genetické testování se tak stává nedílnou součástí moderní diagnostiky karcinomu prostaty a umožňuje identifikovat pacienty, kteří mohou profitovat z cílené léčby. V klinické praxi se u těchto pacientů uplatňují zejména inhibitory PARP, které využívají principu syntetické letality a cíleně působí na nádorové buňky s poruchou reparace DNA. Tento personalizovaný přístup vede ke zvýšení účinnosti léčby, oddálení progrese onemocnění a k prodloužení celkového přežití pacientů. Přednáška poskytuje přehled současných diagnostických a terapeutických možností s důrazem na význam integrace genetických informací do klinického rozhodování a individualizace péče o pacienta.

9. SOMATICKÉ NGS VYŠETŘENÍ V ONKOLOGII A JEHO PŘESAH DO KLINICKÉ GENETIKY

BERKOVCOVÁ J.¹, HORKÝ O.¹, LOCHMANOVÁ J.¹, SŤAHLOVÁ HRABINCOVÁ E.¹, ZATLOUKALOVÁ R.¹, BABÁNKOVÁ I.¹, GRELL P.², ZAVADIL KOKÁŠ F.³, MACHÁČKOVÁ E.⁴, NOVÁKOVÁ K.⁴

¹ Onkologické patologie, MOÚ Brno, ² Komplexní onkologické péče, MOÚ Brno, ³ RECAMO, MOÚ Brno, ⁴ Centrum lékařské genetiky, MOÚ Brno

Masivně paralelní sekvenování (NGS) se stalo nedílnou součástí moderní diagnostiky v onkologii a je základem pro personalizovanou medicínu. Somatické testování nádorové tkáně umožňuje identifikaci prediktivních biomarkerů pro cílenou léčbu, ale také prognostických a diagnostických znaků pro účely upřesnění diagnózy. Současně však může odhalit i varianty s možným germinálním původem. Výsledky somatického NGS vyšetření tak mohou mít význam nejen pro samotného pacienta, ale i pro jeho biologické příbuzné. Tím představují důležitý přesah do oblasti klinické genetiky. Molekulární tumor board (MTB) je komise založená na multioborové spolupráci mezi molekulárními biology, patology, bioinformatiky, klinickými onkology, farmakology a klinickými genetiky při interpretaci somatických NGS nálezů. Doporučením MTB je nejen specifický léčebný přístup, ale také mnohdy identifikace pacientů vhodných k následné genetické konzultaci a potvrzení konkrétních nalezených variant na germinální úrovni. V přednášce budou prezentovány zkušenosti s interpretací somatických NGS vyšetření v rutinní onkologické diagnostice se zaměřením na varianty v genech asociovaných s hereditární nádorovou predispozicí. Diskutovány budou indikace k doporučení pacienta na pracoviště lékařské genetiky, význam korelace molekulárního nálezu s osobní a rodinnou anamnézou a role MTB v rozhodovacím procesu. Molekulární profilování nádoru pomocí NGS může představovat významný nástroj pro záchyt pacientů s možnou hereditární predispozicí k nádorovým onemocněním. Správná interpretace nálezů vyžaduje mezioborový přístup a efektivní komunikaci mezi jednotlivými odbornostmi. Potvrzení varianty na germinální úrovni může mít zásadní dopad na další dispenzarizaci pacienta, terapeutické rozhodování i preventivní péči o rodinné příslušníky. Integrace somatického NGS testování a klinické genetiky představuje důležitý aspekt personalizované medicíny. Multioborová spolupráce umožňuje efektivnější identifikaci pacientů s hereditární nádorovou predispozicí a přispívá k individualizaci diagnostického i terapeutického postupu.

276. SYSTÉMOVÁ LÉČBA PLEXIFORMNÍCH NEUROFIBROMŮ U NEUROFIBROMATÓZY 1. TYPU: ZACÍLENÍ PREKURZORU MPNST MEK INHIBITORY

PACAS P., KOPEČKOVÁ K.

Onkologická klinika, 2. LF UK a FNMH Praha

Východiska: Neurofibromatóza 1. typu (NF1) je častý autozomálně dominantní syndrom nádorové predispozice (~1 na 2 500 narozených) způsobený ztrátovými variantami genu NF1 kódujícího neurofibromin, tumor supresor dráhy RAS. Plexiformní neurofibromy (PN) se rozvíjejí u 30–50 % pacientů a přes svou benigní povahu způsobují zásadní morbiditu bolestí, znetvořením, útlakem a neurologickým deficitem. PN jsou obligátními prekurzory maligních nádorů pochev periferních nervů (MPNST) s celoživotním rizikem transformace 8–15 %, MPNST má nepříznivou prognózu a je hlavní příčinou úmrtí spojených s NF1. Progrese probíhá přes atypický neurofibrom (ANNUBP) na podkladě sekvenční alterace NF1, ztráty CDKN2A/2B a změn regulátorů chromatinu, což činí ze systémové kontroly prekurzorové léze racionální onkologickou prioritu. Etiopatogeneze a léčba: Ztráta neurofibrominu vede ke konstitutivní signalizaci RAS–RAF–MEK–ERK, což zakládá zdůvodnění inhibice MEK. Chirurgie dosahuje úplné excize jen u ~15 % PN s častou recidivou; radioterapie se obecně nevyužívá. V rámci systémové léčby jsou dispozici jsou dva perorální inhibitory MEK: selumetinib a mirdametinib. Klinická data: Ve studii fáze 2 SPRINT (n = 50 dětí) dosáhl selumetinib 66% míry objektivní odpovědi (44 % dle nezávislého přezkumu), se zlepšením bolesti, funkce a kvality života. Pivotní studie fáze 2b ReNeu (n = 114; 58 dospělých, 56 dětí) s mirdametinibem splnila primární cíl s potvrzenou mírou objektivní odpovědi 41 % u dospělých a 52 % u dětí, mediánem nejlepší redukce objemu PN −41 % a −42 %, hlubokými odpověďmi (> 50 %) u více než poloviny respondérů a nedosaženým mediánem trvání odpovědi. Bolest a kvalita života se významně a časně zlepšily (od cyklu 3) a přetrvávaly po celou léčbu. Toxicita byla převážně stupně 1–2 (akneiformní dermatitida, průjem, nauzea), zvládnutelná úpravou dávky bez ztráty účinnosti. Závěr: Inhibice MEK proměnila symptomatické, neresekabilní NF1-PN z neléčitelného stavu v onemocnění přístupné trvalé systémové kontrole s významnou úlevou od bolesti a morbidity. Ačkoliv onemocnění modifikující účinek na maligní transformaci zůstává neprokázaný a PN mohou po vysazení znovu růst, léčba prekurzoru MPNST ustanovuje inhibitory MEK jako základní kámen současného managementu NF1 v rámci multidisciplinární péče.

316. MALIGNÍ MELANOM –⁠ VÝSLEDKY MOLEKULÁRNĚ GENETICKÉHO TESTOVÁNÍ NGS PANELEM CZECANCA NA MASARYKOVĚ ONKOLOGICKÉM ÚSTAVU

GRELL R., MIŠOVE A., NAVRÁTILOVÁ M., VALÍČKOVÁ A., MACHÁČKOVÁ E., HÁZOVÁ J., VAŠÍČKOVÁ P., FORETOVÁ L., NOVÁKOVÁ K.

Centrum lékařské genetiky, ERN Genturis, MOÚ Brno

Úvod: Maligní melanom patří k vysoce agresivním maligním nádorům s invazivním růstem a výrazným metastatickým potenciálem. V etiopatogenezi se nejvíce uplatňuje chronická expozice UV záření, která vede k akumulaci somatických mutací. Přibližně u 50 % kožních nádorů je přítomna somatická patogenní varianta v genu BRAF V600E, časté jsou také alterace v genech NRAS, KIT, NF1. Maligní melanom se vyskytuje ve všech věkových kategoriích, včetně dětského věku, a u mladých dospělých, u nichž více předpokládáme možnou vrozenou genetickou příčinu (germinální mutaci). Metody: Do sledovaného souboru bylo zařazeno 103 pacientů s diagnózou maligního melanomu, kteří byli testováni v průběhu šestiletého období od 7. dubna 2020 do 21. dubna 2026. U všech pacientů bylo provedeno genetické vyšetření pomocí sekvenování nové generace (NGS), panel CZECANCA. Věkové rozmezí sledované skupiny se pohybovalo od 18 do 75 let. Průměrný věk pacientů v souboru činil 36,2 roku s mediánem 35 let. Výsledky: Kauzální germinální varianta byla nalezena u 6,8 % pacientů, což představuje celkem sedm případů, přičemž u všech těchto jedinců byl diagnostikován kožní melanom. Konkrétně se jednalo o alternace v genech CDKN2A (2×), BRCA1 (1×), ATM (3×) a PRKAR1A (1×). Průměrný věk pacientů se záchytem této kauzální patogenní mutace byl 37,1 roku s mediánem 42 let. U dalších 14 pacientů, z nichž 13 mělo kožní melanom a jeden melanom oka, byly detekovány patogenní varianty nebo varianty nejasného významu (VUS) v genech, u kterých dosud není potvrzena přímá souvislost s maligním melanomem. Jednalo se především o geny podílející se na procesech reparace DNA. Analýza anamnézy ukázala významné rozdíly v rodinném výskytu onemocnění v závislosti na konkrétním mutovaném genu, přičemž nejvýraznější souvislost byla zjištěna u pacientů s mutací v genu CDKN2A (6–8 případů v rodině) a ATM (3 a více případů v rodině). Závěr: Naše výsledky potvrzují, že z hlediska rizika rozvoje maligního melanomu představuje nejvýznamnější genetický faktor mutace v genu CDKN2A. V souladu s literárními údaji se i v našem souboru ukázalo, že nejzásadnějším prediktorem dědičného rizika maligního melanomu s CDKN2A mutací je přítomnost tří a více příbuzných s melanomem v rodinné anamnéze, u ostatních genů se jedná i o přítomnost dalších nádorových onemocnění v rodinné anamnéze. Naopak pouze nízký věk pacienta v době manifestace onemocnění se nejeví jako zásadní faktor ovlivňující pravděpodobnost záchytu germinální mutace.

319. GENETICKÉ VYŠETŘENÍ U PACIENTŮ S KARCINOMEM PROSTATY

HÁZOVÁ J., MACHÁČKOVÁ E., VAŠÍČKOVÁ P., MIŠOVE A., SVOBODA M., FORETOVÁ L., NAVRÁTILOVÁ M., VALÍČKOVÁ A., GRELL R., NOVÁKOVÁ K.

Centrum lékařské genetiky, MOÚ Brno

Východiska: Karcinom prostaty je nejčastějším onkologickým onemocněním u mužů s celosvětově narůstající incidencí. V České republice je každoročně diagnostikováno více než 8 000 nových případů. Asi u 10–15 % případů může být C61 spojen s hereditární predispozicí podmíněnou patogenní variantou v některém z vysoce penetrantních genů. Dle NCCN (2026) je u nádorů prostaty doporučeno genetické vyšetření genů ATM, BRCA1, BRCA2, CHEK2, HOXB13, PALB2 a TP53. Aktuální indikační kritéria doporučují testování každého pacienta s diagnózou (dg.) C61 ≤ 50 let věku; pro účely personalizované medicíny je pak testování indikováno u pacientů s primárně metastatickým, lokálně pokročilým nebo vysoce rizikovým nádorem. Na základě rodinné anamnézy se doporučuje testování u pacientů s dg. C61, kteří mají příbuzného 1. stupně s dg. C61 ≤ 55 let, nebo při výskytu alespoň dvou případů C61 v rodině. Soubor pacientů a metody: V laboratoři bylo vyšetřeno celkem 171 vzorků germinální DNA od nepříbuzných pacientů s karcinomem prostaty. Celkem 21 vzorků bylo vyšetřeno dříve používanou metodikou zaměřenou pouze na geny BRCA1 a BRCA2, 150 vzorků bylo vyšetřeno multigenovým panelem metodou NGS. Celkem 15 pacientů mělo diagnózu C61 ve věku 38–50 let, 56 pacientů ve věku 51–60 let, 59 pacientů ve věku 61–70 let a 41 pacientů ve věku 71–82 let. Výsledky: Patogenní mutace v genech dle doporučení NCCN byla zachycena celkem v 9,9 % případů. U dg. ve věku 38–50 let byl záchyt ve 6,7 %, u dg. ve věku 51–60 let v 8,9 %, u dg. ve věku 61–70 let v 11,9 % a u dg. ve věku 71–82 let v 9,7 %. Z genů doporučených NCCN byly detekovány patogenní mutace v genu BRCA2 (10×), ATM (4×), BRCA1 (1×), PALB2 (1×) a HOXB13 (1×). Mezi další častější nálezy mimo spektrum NCCN genů patří mutace v genech recesivních syndromů jako např. NBN (3×), MUTYH (3×), dále v HNPCC genech (MSH6 –⁠ 1×, PMS2 –⁠ 1×) a v dalších genech reparačních drah (např. HELQ –⁠ 3×), u kterých není v současnosti známa přímá asociace s karcinomem prostaty, ale mohou zvyšovat onkologické riziko. Závěr: Karcinom prostaty má u nosičů zárodečných mutací často agresivnější průběh a vyšší mortalitu. Nález patogenní mutace má vliv nejen na léčbu a další sledování samotného pacienta, ale pomáhá identifikovat vysoce rizikové rodiny, kterým je pak nabídnuta adekvátní preventivní péče v závislosti na konkrétním predispozičním genu. CLG je členem ERN GENTURIS (European Reference Network on Genetic Tumour Risk Syndromes).

353. RNA-SEQ WITHOUT NMD INHIBITION SUPPORTS INTERPRETATION OF SPLICEOGENIC VARIANTS IN LYNCH SYNDROME GENES

MIŠOVE A.¹, MACHÁČKOVÁ E.¹, HÁZOVÁ J.¹, VAŠÍČKOVÁ P.¹, KLEIBLOVÁ P.², NEHASIL P.², FORETOVÁ L.¹, NOVÁKOVÁ K.¹

¹ Department of Cancer Epidemiology and Genetics (DCEG), Masaryk Memorial Cancer Institute, Brno, ² Institute of Medical Biochemistry and Laboratory Diagnostics, First Faculty of Medicine, Charles University and General University Hospital, Prague

Background: Spliceogenic variants represent an important loss-of-function mechanism in Lynch syndrome (LS) genes (MLH1, MSH2, MSH6, PMS2). Their accurate interpretation is clinically critical, as variant classification directly informs cancer surveillance strategies and cascade testing of relatives. However, DNA-based testing and in silico prediction alone are insufficient to reliably determine the transcript-level consequences of suspected splice variants. Even canonical splice-site variants may occasionally result in non-pathogenic outcomes, supporting the need for transcript verification to avoid inappropriate clinical management. Since many mRNA assays rely on lymphocyte culture and/or nonsense-mediated decay (NMD) inhibition, we evaluated whether targeted RNA-Seq from whole blood without NMD inhibition can still provide clinically meaningful splicing evidence for variant interpretation. Patients and methods: Patients carrying suspected LS-associated spliceogenic variants identified by DNA testing were included. RNA extracted from Tempus blood was analysed by targeted RNA capture sequencing using Kapa RNA HyperPrep, a custom hereditary cancer panel, and Illumina MiSeq sequencing. Splicing consequences were assessed by transcript alignment and comparison with internal controls; selected abnormal events were confirmed by cDNA PCR/Sanger sequencing. Allele-specific expression was evaluated when a heterozygous SNP enabled allele-level read counting. Results: We analysed 15 suspected spliceogenic variants: 10 variants of unknown significance (VUS) and 5 likely pathogenic variants. Published RNA data were available for four variants, and our RNA-Seq results were largely concordant. Aberrant splicing was confirmed in three canonical splice-site variants (MSH2 c.2211-1G>A, MSH6 c.627+1G>A, MSH6 c.628-5_628-1delins14) and one additional likely pathogenic candidate (MSH2 c.1759G>A). RNA-Seq enabled the reclassification of 60 % (6/10) VUS: five to likely benign and one (MSH2 c.1386G>C) to likely pathogenic. Conclusion: Targeted RNA-Seq without NMD inhibition provides a practical, cost-effective first-line approach for assessing suspected spliceogenic variants in LS genes, reserving culture-based and/or NMD-inhibited studies for unresolved findings or low-expression cases.

Supported by Ministry of Health of the Czech Republic: AZV project NU23-03-00150; and ERN GENTURIS.