Cirkulující nádorová DNA u HPV asociovaných nádorů hlavy a krku – nový klinický nástroj v éře precizní onkologie

Súhrn

Východiska: Dlaždicobuněčný karcinom hlavy a krku (head and neck squamous cell carcinoma –⁠ HNSCC) představuje globálně závažný onkologický problém s rostoucí incidencí, zejména v důsledku HPV asociovaných orofaryngeálních karcinomů (oropharyngeal squamous cell carcinoma –⁠ OPSCC). Tyto nádory se liší od HPV negativních jednotek biologicky, klinicky i prognosticky. Konvenční diagnostické postupy, založené na tkáňové biopsii a zobrazovacích metodách, mají řadu limitací –⁠ od invazivity přes nemožnost sledovat dynamiku onemocnění až po nízkou senzitivitu při časné detekci recidiv. Cíl: Tato práce poskytuje komplexní přehled o problematice cirkulující nádorové DNA (ctDNA), konkrétně HPV asociované ctDNA, jako nového neinvazivního biomarkeru umožňujícího přesnější diagnostiku, sledování léčebné odpovědi a časnou detekci recidiv u pacientů s HNSCC. Závěr: ctDNA vykazuje specifické biologické a fyzikální vlastnosti, které umožňují její spolehlivou detekci a odlišení od běžné cirkulující DNA. Díky krátkému poločasu rozpadu poskytuje informace o dynamice onemocnění v reálném čase, přičemž její koncentrace i fragmentační vzorce odrážejí nádorovou zátěž a aktivitu onemocnění. Monitorování ctDNA má potenciál stát se zásadním klinickým nástrojem v éře precizní onkologie, neboť umožňuje časnější diagnostiku recidivy, přesnější stratifikaci pacientů a optimalizaci léčebných strategií u HPV asociovaných OPSCC.

Klíčová slova:

dlaždicobuněčný karcinom hlavy a krku – lidský papilomavirus, cirkulující nádorová DNA (ctDNA) – precizní medicína v onkologii

Úvod

Dlaždicobuněčný karcinom hlavy a krku (head and neck squamous cell carcinoma –⁠ HNSCC) představuje onkologickou diagnózu s přibližně 931 000 novými případy a 467 000 úmrtími ročně. HPV pozitivní HNSCC, zejména orofaryngeální karcinom (oropharyngeal squamous cell carcinoma –⁠ OPSCC), představuje fyziologicky i klinicky odlišnou entitu oproti HPV negativnímu nádoru. Z epidemiologického hlediska se tyto nádory častěji vyskytují u mladších osob a nekuřáků [1,2].

HPV DNA se integruje do genomu hostitele a dochází k expresi virových onkoproteinů E6 a E7, které inaktivují tumor supresorové proteiny p53 a Rb. HPV pozitivní nádory vykazují lepší odpověď na léčbu, vyšší míru přežití a odlišné vzorce metastazování. Pacienti s HPV pozitivním OPSCC mají 5letou míru přežití 85–90 %, zatímco u HPV negativních případů se toto přežití pohybuje mezi 40–60 % [3–5].

Standardní diagnostika HNSCC spočívá v invazivním odběru tkáně, jenž může být obtížný u anatomicky složitě přístupných oblastí. Navíc tkáňová biopsie poskytuje pouze statický obraz nádoru v čase odběru, nikoliv dynamické změny, které se odehrávají během progrese nebo léčby. Vzhledem k nádorové heterogenitě nemusí malý vzorek odpovídat skutečné nádorové zátěži. Monitorování léčebné odpovědi komplikuje i obtížné rozlišení mezi reziduálním nádorem a poradiačními změnami. V neposlední řadě mají konvenční zobrazovací metody nízkou senzitivitu pro časnou detekci recidivy [6].

 

Cirkulující nádorová DNA –⁠ biologické základy a mechanizmy

Cirkulující nádorová DNA (ctDNA) představuje fragmenty DNA, které jsou uvolňovány z nádorových buněk do krevního oběhu prostřednictvím několika mechanizmů. Patří mezi ně apoptóza, tedy programovaná buněčná smrt, při níž dochází k uvolnění fragmentovaných nukleových kyselin. Dalším mechanizmem je nekróza, při níž nastává nekontrolovaná buněčná smrt s masivním uvolněním buněčného obsahu. ctDNA může být rovněž uvolňována aktivní sekrecí. Předpokládá se, že k množství ctDNA v oběhu přispívá i lýza cirkulujících nádorových buněk (CTC). Studie naznačují, že lýza CTC prostřednictvím fagocytózy nádorově asociovanými makrofágy (TAMs) může vést k uvolnění DNA do cirkulace. Množství ctDNA v oběhu je ovlivněno typem rakoviny, stadiem nádoru, nádorovou zátěží, buněčným obratem a odpovědí na léčbu [7,8].

ctDNA vykazuje specifické biologické a fyzikální vlastnosti, které umožňují její detekci a odlišení od běžné cirkulující volné DNA (cfDNA). Jedním z hlavních rozlišovacích parametrů je velikost fragmentů –⁠ ctDNA se typicky vyskytuje ve fragmentech o délce 150–200 párů bází, přičemž fragmenty vzniklé apoptózou dosahují délky 160–180 bp a ty aktivně secernované se pohybují mezi 150–250 bp. Průměrná délka ctDNA činí přibližně 176 bp, přičemž v případě HPV asociované ctDNA bývá velikost fragmentů ještě kratší [6,7,9]. Důležitým parametrem je také poločas rozpadu, který se u cfDNA pohybuje mezi 10 a 15 minutami. Díky tomu lze ctDNA využít pro sledování dynamiky onemocnění v reálném čase [7]. Koncentrace ctDNA v cirkulaci bývá obecně velmi nízká –⁠ u časných stadií nádorů tvoří méně než 0,01 % celkové cfDNA, zatímco u pokročilých onemocnění může dosahovat až 10 % [7]. Kromě kvantitativních charakteristik vykazuje ctDNA i specifické fragmentomické vzorce, např. stereotypní vzorce fragmentace pozorované u HPV genomů, což může dále zvýšit její diagnostickou a prognostickou hodnotu [6].

 

Metodologie detekce ctDNA

Kvantitativní PCR

Kvantitativní PCR (qPCR) představuje zavedenou a široce využívanou metodu pro detekci HPV DNA v různých typech vzorků, včetně plazmy, séra, slin a orálních výplachů. Senzitivita této metody se však mezi studiemi výrazně liší –⁠ pohybuje se v rozmezí 2,1–67,3 % v závislosti na typu vzorku, cílené oblasti genomu HPV (např. E6/E7) a použitém protokolu. V některých studiích uvádí citlivost 20,6 % v plazmě a pouhých 2,1 % v orálním výplachu [10,11], zatímco jiné dosahují citlivosti až 67,3 % při současné detekci E6 a E7 genů v plazmě [10,11]. Specificita qPCR bývá obecně vysoká –⁠ některé studie udávají 100% specificitu [8,10], jiné uvádějí hodnoty mezi 71,6 % a 97 % v závislosti na testu [5]. Limit detekce qPCR se pohybuje přibližně kolem 8 ± 3,4 kopie na reakci [10,11].

Navzdory těmto výhodám má qPCR i svá omezení. Nejvýraznější slabinou je nízká citlivost při detekci ctDNA, zejména u pacientů s nízkým počtem virových kopií [9–11]. Dále je zde omezená možnost multiplexace –⁠ ačkoli existují multiplexní qPCR testy pro detekci více typů HPV, jejich kapacita je výrazně nižší než u metod typu NGS [8,9,11]. Kromě toho qPCR neumožňuje komplexní genotypizaci všech variant HPV v jediné reakci a často vyžaduje doplňující testy pro identifikaci dalších subtypů [5,9,11]. Výsledky qPCR jsou rovněž silně závislé na kvalitě návrhu testu, např. na specifitě primerů, pozadí fluorescenčního signálu a přesnosti standardní křivky. Při velmi nízkém počtu virových kopií je obtížné spolehlivě odlišit falešně pozitivní od skutečně pozitivních vzorků, což může snižovat klinickou využitelnost této metody u časných stadií onemocnění [10,11].

 

Droplet digital PCR

Droplet digital PCR (ddPCR) představuje významný technologický pokrok oproti konvenční qPCR a nabízí řadu výhod. Senzitivita ddPCR se pohybuje v závislosti na typu vzorku a konkrétní studii od 37,9 % (např. ve slinách) až po 98,6 % (např. při diagnostice HPV pozitivního OPSCC) [6,10,11], přičemž v plazmatických vzorcích často dosahuje 66,7–95,9 % [9–11]. Specificita metody je velmi vysoká, běžně se udává v rozmezí 99–100 % [9,11]. Velkou výhodou ddPCR je její nízký detekční limit, který se pohybuje kolem 2 ± 1,1 kopie na reakci, což umožňuje spolehlivou detekci i při nízké virové zátěži [10,11].

Jedním z nejvýznamnějších přínosů této technologie je také schopnost absolutní kvantifikace –⁠ ddPCR umožňuje přesně určit počet kopií DNA bez nutnosti vytvářet standardní křivku, což zvyšuje robustnost a reprodukovatelnost výsledků [10,11]. Mezi hlavní omezení však patří skutečnost, že metoda je zaměřena primárně na detekci známých mutací nebo virových sekvencí v tzv. hotspot oblasti [9,10]. Ve srovnání s NGS má ddPCR omezené možnosti multiplexace, a při potřebě detekovat více mutací je nutné rozdělit vzorek DNA do několika paralelních reakcí. To může být problematické zejména u vzorků s limitovaným množstvím DNA, kde dochází ke ztrátě citlivosti [11,13].

 

Sekvenování nové generace

Sekvenování nové generace (next generation sequencing –⁠ NGS) představuje nejpokrokovější platformu pro analýzu ctDNA a nabízí jedinečné možnosti v oblasti diagnostiky a monitorování nádorových onemocnění. Obecné NGS přístupy dosahují senzitivity 75–100 % [9–11] pro detekci HPV a specificity 98 % [5,11]. Umožňují komplexní genomovou analýzu, detekci neznámých mutací a analýzu ultrakrátkých fragmentů ctDNA [10,11].

Mezi specifické metody NGS patří:

 

CAPP-Seq (cancer personalized profiling by deep sequencing)

Tato metoda využívá hybrid capture s panely optimalizovanými pro HNSCC. Dosahuje senzitivity 51,7 % při základní detekci u HNSCC. Výhodou je personalizovaný přístup a široké genomové pokrytí, ale oproti tumor specifickým metodám vykazuje nižší senzitivitu [11].

 

HPV-seq

HPV-seq představuje nejcitlivější metodu pro detekci HPV ctDNA. Využívá dual-strand hybrid capture pokrývající celý HPV genom a dosahuje 100% senzitivity pro detekci minimální reziduální nemoci (minimal residual disease –⁠ MRD) s detekčním limitem pod 0,03 kopie/ml plazmy. Současně umožňuje genotypizaci a kvantifikaci všech genotypů HPV, provádí fragmentomickou analýzu a identifikuje místa integrace HPV DNA, čímž překonává limitace ddPCR [11].

 

RaDaR assay

Tato metoda využívá multiplexní PCR amplifikaci tumor specifických variant a dosahuje 88% senzitivity při základní detekci u pokročilého HNSCC (LA-HNSCC) a 100% specificity pro detekci MRD. Je ideální pro monitorování nonvirových HNSCC, kde není přítomna HPV DNA [11]. Srovnání detekčních metod je uvedeno v tab. 1.

Biologické materiály pro analýzu ctDNA

Krevní plazma

Krevní plazma zůstává nejčastěji používaným biologickým materiálem pro analýzu ctDNA. Mezi hlavní výhody patří nejširší klinická zkušenost, standardizované protokoly a schopnost reprezentovat systémovou nádorovou zátěž, což ji činí vhodnou pro všechny lokalizace HNSCC. Technické aspekty zahrnují použití EDTA jako preferovaného antikoagulancia, nutnost zpracování vzorku do 4 hodin od odběru, koncentrace ctDNA je obvykle pod 1 % celkové cfDNA. Mezi omezení patří invazivní charakter odběru, možnost kontaminace genomickou DNA, vliv zánětlivých procesů a degradace ctDNA při dlouhodobém skladování [11,13]. Např. zkumavky PAXgene^® Blood ccfDNA Tube jsou speciálně vyvinuté odběrové zkumavky pro stabilní uchování cirkulující buněčně volné DNA (ccfDNA/cfDNA) v plné krvi.

 

Sliny

Sliny představují atraktivní neinvazivní alternativu ke krevní plazmě. Klinické výhody zahrnují 93% konkordanci s plazmou při detekci ctDNA, vhodnost zejména pro orální a orofaryngeální karcinomy, snadný a opakovaný odběr a často vyšší koncentrace ctDNA u lokálně pokročilých nádorů. Molekulárně jsou sliny bohatým zdrojem biomarkerů včetně ctDNA, RNA, proteinů a metabolitů, přičemž HPV ctDNA dosahuje podobné úrovně jako v plazmě, což je vhodné pro monitorování OPSCC. Limitaci představuje nižší koncentrace ctDNA u systémových metastáz, kontaminace bakteriální DNA a variabilita produkce slin [5,11].

 

Jiné materiály

Moč a pleurální tekutina jsou uváděny jako potenciální biofluidy využitelné pro účely tekuté biopsie, nicméně jejich uplatnění v kontextu detekce HPV DNA u HNSCC zatím zůstává nejasné. Přestože některé zdroje zmiňují moč jako vhodný materiál pro neinvazivní diagnostiku, konkrétní údaje týkající se přítomnosti HPV DNA v moči pacientů s HNSCC chybějí [6].

 

Klinické aplikace ctDNA u HPV pozitivních HNSCC

Diagnostika

Detekce HPV specifické ctDNA přináší nové možnosti v oblasti časné diagnostiky HPV pozitivních HNSCC. Tekuté biopsie, které zahrnují detekci HPV ctDNA, představují slibnou minimálně invazivní techniku, která může snížit zátěž pro pacienty i zdravotnický systém v diagnostice HPV pozitivních HNSCC [6,11].

Schopnost detekovat i malé nádory naznačuje, že HPV ctDNA by mohla být snadno využitelná ve screeningových studiích pro časný záchyt onemocnění [9,11]. V několika studiích byla HPV ctDNA detekována dokonce několik let před klinickým projevem onemocnění, což otevírá cestu k presymptomatickému záchytu. Studie Rettiga et al. ukázala, že HPV ctDNA byla přítomna v plazmě přibližně 30,5 měsíce před stanovením diagnózy u 43 % pacientů s HPV pozitivním OPSCC [6,11].

Tato metoda může také sloužit ke screeningu rizikových populací, např. asymptomatických jedinců s vysokou virovou zátěží. Účelem tekuté biopsie ve screeningovém kontextu by bylo identifikovat subklinické nádory v časném stadiu onemocnění [9,11]. Např. detekce nádorové DNA viru Epsteina-Barrové (EBV) v plazmě je používána ve screeningu nazofaryngeálního karcinomu (nasopharyngeal carcinoma –⁠ NPC) v endemických oblastech, což demonstruje, že NPC lze zachytit u asymptomatických pacientů v časnějším stadiu [9,11]. Tento přístup lze považovat za analogii pro detekci HPV ctDNA.

V případech, kdy není dostupné dostatečné množství nádorové tkáně z biopsie, může HPV ctDNA napomoci diferenciální diagnostice mezi HPV pozitivními a HPV negativními nádory. Standardní diagnostické metody založené na biopsii tkání jsou invazivní, vyžadují delší dobu zpracování a přípravy vzorku a často je k dispozici nedostatečné množství materiálu pro komplexní genomovou analýzu [6,7,11]. Ve studii byla HPV ctDNA detekována v předléčebných plazmatických vzorcích u většiny pacientů s HPV pozitivním OPSCC, ale u žádného pacienta s HPV negativním HNSCC ani u zdravých kontrol [8]. To poukazuje na potenciál pro využití v diferenciální diagnostice. Pokud není chirurgický zákrok možný ze zdravotních důvodů, může ctDNA představovat cennou alternativu pro molekulární stratifikaci a výběr vhodné terapie [10,13].

 

Molekulární staging

Kvantifikace ctDNA může sloužit jako objektivní ukazatel nádorové zátěže –⁠ její hladiny často korelují s objemem primárního tumoru. Výzkum prokázal souvislost mezi množstvím HPV ctDNA detekovaným v krvi a charakteristikami onemocnění, jako jsou velikost nádoru a klinické stadium [6,7,11]. Předléčebné počty kopií HPV DNA v plazmě signifikantně korelovaly s metabolickým objemem nádoru v uzlinách (hodnoceným pomocí FDG-PET) [8]. Významná je rovněž schopnost ctDNA detekovat u HPV pozitivních pacientů s HNSCC okultní metastatické postižení v případech, kdy je radiologické vyšetření negativní [6,11].

 

Monitorování terapeutické odpovědi

Kinetika ctDNA během léčby

Analýza dynamiky HPV specifické ctDNA poskytuje cenné informace o průběhu léčby. U léčených pacientů je rychlý pokles hladin ctDNA spojen s dobrou léčebnou odpovědí [6,8,9,11]. Naopak perzistence ctDNA po léčbě signalizuje reziduální chorobu nebo recidivu [6,7, 8,10]. Během systémové léčby, zejména imunoterapie, může ctDNA sloužit jako časný ukazatel účinnosti terapie [13]. Kinetika HPV ctDNA tedy obecně koreluje s kontrolou onemocnění [7,11].

 

Personalizace léčby

Na základě kinetiky ctDNA lze individualizovat léčebný přístup. Pacienti s rychlým poklesem ctDNA mohou být vhodní kandidáti k deeskalaci léčby, což vede ke snížení toxicity [10,12,14]. Naopak perzistence ctDNA může indikovat potřebu intenzifikace nebo změny terapeutické strategie [6,8,11]. V kontextu adjuvantní terapie mohou být pacienti s detekovatelnou MRD vhodnými kandidáty pro její nasazení [6,7].

 

Detekce MRD

Definice a časování

MRD je definována jako detekce ctDNA, konkrétně HPV ctDNA, po ukončení kurativní léčby [6,8,11,15]. Longitudinální monitorování HPV ctDNA během postléčebného sledování dokáže přesně detekovat klinickou recidivu onemocnění [11,15]. Optimální čas pro její vyhodnocení je mezi 4. a 8. týdnem po terapii, kdy by již měla být dosaženo biologické clearance ctDNA [6,9]. Obecně bylo dosaženo nedetekovatelných hladin HPV16 ctDNA do 6.–7. týdne od začátku chemoradioterapie [6,9].

Pozitivní nález MRD po tomto období je spojen se sedminásobně vyšším rizikem relapsu. Konkrétně, přítomnost HPV ctDNA pro detekci recidivy onemocnění má poměr rizika (hazard ratio) 7,97 [6]. Detekce HPV ctDNA ve dvou po sobě jdoucích vzorcích plazmy měla vysokou (94 %) pozitivní prediktivní hodnotu (95% CI 70–099 %) a 100% negativní prediktivní hodnotu (95% CI 96–100 %) pro identifikaci recidivy onemocnění [11], a naopak u pacientů s nedetekovatelnou HPV ctDNA ve všech postléčebných časových bodech nedošlo k recidivě nádorového onemocnění [11].

 

Metodologické aspekty

Pro detekci MRD se ukazuje jako velmi účinný přístup založený na sekvenování HPV (HPV-seq), což je typ technologie NGS s citlivostí testu 95 % a specificitou 98,1 % [5]. Technologie eTAm-Seq prokázala citlivost 99,17 % [13].

Pro porovnání, droplet digitální PCR (ddPCR) pro HPV16 ctDNA dosáhla ve studiích citlivosti 70–92,8 % [9,10]. Výsledky publikovaných studií tak naznačují vyšší detekční citlivost HPV-seq než ddPCR.

 

Prognostická hodnota ctDNA

Následující podkapitoly se věnují jednotlivým aspektům klinické užitečnosti HPV ctDNA –⁠ bazálním hladinám před léčbou, dynamice během léčby a významu poléčebné detekce v predikci klinických výsledků.

 

Význam bazální ctDNA (baseline)

Koncentrace HPV ctDNA v plazmě před zahájením léčby je v literatuře často uváděna jako ukazatel rozsahu onemocnění [6]. Studie prokázaly, že bazální hladiny HPV ctDNA korelují s objemem nádoru v lymfatických uzlinách a s celkovým stadiem onemocnění [8]. Vyšší počáteční hladiny HPV ctDNA jsou spojeny s pokročilejším stadiem onemocnění [6,13]. Jsou však publikována data, kde byl zaznamenán pouze mírný trend k vyšší koncentraci HPV ctDNA u pokročilejších stadií onemocnění a statisticky významná korelace mezi bazálními hladinami HPV ctDNA a prognózou (např. přežíváním bez progrese nebo celkovým přežíváním) nebyla vždy jednoznačně prokázána a výsledky v literatuře jsou v tomto ohledu nejednotné [7].

 

Poléčebná ctDNA a klinické výsledky

Monitorování HPV ctDNA po ukončení léčby se ukázalo jako cenný prognostický marker pro HPV asociovaný OPSCC [10]. U pacientů, u nichž byla HPV ctDNA po léčbě ve všech časových bodech nedetekovatelná, nebyla zaznamenána žádná recidiva onemocnění, což odpovídá 100% negativní prediktivní hodnotě (NPV) [11]. Naopak dva po sobě následující pozitivní testy HPV ctDNA v rámci sledování po léčbě vykazovaly pozitivní prediktivní hodnotu (PPV) 94 % pro biopticky potvrzenou recidivu [10]. Medián intervalu mezi první pozitivitou HPV ctDNA a biopticky verifikovanou recidivou činil 3,9 měsíce [11]. Přítomnost HPV ctDNA po léčbě je obecně silně spojena s nepříznivou prognózou, včetně kratší doby přežívání bez relapsu, přežívání bez progrese i celkového přežívání [6]. Nedostatečná eliminace HPV ctDNA po terapii významně koreluje s rizikem relapsu onemocnění [6]. Tato zjištění naznačují, že monitorování HPV ctDNA může napomoci časné detekci recidivy a potenciálně zvýšit účinnost následné záchranné léčby [6].

 

Dynamika ctDNA během léčby

Dynamika HPV ctDNA během léčby vypovídá o odpovědi nádoru na léčbu. Během chemoradioterapie dochází k rychlému poklesu hladin HPV ctDNA, což koreluje s kontrolou onemocnění a úspěšným terapeutickým efektem [8]. Po ukončení radioterapie nebo krátce po dokončení úspěšné léčby se HPV ctDNA stává nedetekovatelnou [8]. V některých případech bylo v prvních týdnech po zahájení chemoradioterapie pozorováno přechodné zvýšení koncentrace HPV ctDNA, které může být důsledkem zvýšeného uvolňování virové DNA v důsledku buněčné smrti navozené účinnou léčbou [9]. Naopak nárůst hladin HPV ctDNA byl zaznamenán v období metastatického rozsevu nebo při recidivě onemocnění [8]. Celkově bylo prokázáno, že kinetika HPV ctDNA před léčbou i po jejím ukončení úzce koreluje s úspěšností nebo selháním terapie [6,13]. Monitorování dynamiky HPV ctDNA v průběhu léčby i v následném sledování má tedy významný klinický potenciál pro optimalizaci terapie a časnou predikci recidivy onemocnění [6].

 

Závěr

Detekce a kvantifikace ctDNA představuje do budoucna u HPV pozitivních HNSCC zásadní posun v managementu léčby. Dostupná data potvrzují její vysokou diagnostickou přesnost, výraznou prognostickou hodnotu a reálnou klinickou použitelnost v této specifické populaci pacientů. Jako klíčová součást moderní precizní onkologie přináší ctDNA potenciál k individualizaci léčby a optimalizaci sledování, což může významně přispět ke zlepšení výsledků péče prostřednictvím personalizovaných strategií.

 

Dedikace

Práce byla podpořena projektem Ministerstva zdravotnictví ČR –⁠ DRO (Fakultní Thomayerova nemocnice –⁠ TUH, 00064190) a z projektu Národního ústavu pro výzkum rakoviny (Program EXCELES, ID projektu č. LX22NPO5102) –⁠ financovaného Evropskou unií –⁠ Next Generation EU.