Účinky různých typů ionizujícího záření na DNA z pohledu medicíny a plánovaných pilotovaných meziplanetárních letů

Súhrn

Problematika biologických účinků ionizujícího záření (IZ) se vrací do popředí vědeckého výzkumu, a to z několika důvodů. Jedním je další rozvoj nádorové radioterapie a radiační ochrany, nově i v kontextu plánovaných pilotovaných cest na Mars. Velmi silnou negativní motivací je asi historicky nejvyšší riziko zneužití radioaktivních materiálů teroristy a jaderných zbraní teroristickými státy. Nelze vyloučit ani konvenční útoky na jaderná zařízení, doprovázené rozptylem vysoce radioaktivních látek.

Porozumění zdravotním rizikům ozáření a možnostem ochrany před IZ závisí na tom, jak různé typy IZ interagují s živými organismy. Rozdílné působení fotonových a částicových typů záření, se kterými se můžeme setkat nejen na planetě Zemi, ale zejména ve vesmíru, umožňuje vysvětlení rozdílů mezi stochastickými účinky IZ, které mohou být vyvolány již nízkými dávkami záření, a účinky deterministickými, které se objevují jen v případě expozice dávkám vyšším.

Klíčová slova:

DNA – Chromatin – ionizující záření – fotonové záření – hustě ionizující částicové záření – biologické účinky – stochastické účinky – deterministické účinky

ÚVOD –⁠ ROSTOUCÍ VÝZNAM RADIOBIOLOGIE A RADIAČNÍ OCHRANY V KONTEXTU SOUČASNÉHO DĚNÍ

Problematika prevence zdravotních dopadů expozice ionizujícímu záření (IZ) zůstává v centru medicínského zájmu, zejména s cílem dalšího zvýšení účinnosti a bezpečnosti radioterapie zhoubných nádorů (1, 2). V současnosti výzkum biologických účinků IZ znovu nabývá urgentního významu, a to hned z několika důvodů (obr. 1). Zaprvé kvůli výraznému zhoršování geopolitické situace a riziku zneužití jaderných zbraní Ruskem či jinými teroristickými státy a organizacemi (3), zadruhé pak v kontextu radioprotekce posádek plánovaných pilotovaných letů na Měsíc a především na Mars (4). Potřeba radiobiologického výzkumu tak paralelně pramení z oblastí odrážejících maximální excelenci lidského ducha, a naopak totální absenci jakékoliv humanity. Tento paradox je důvodem, proč je radiobiologie od doby prvotní euforie spojena spíše s jakousi pachutí strachu (5).

 

Obr. 1  Oblasti výzkumu biologických účinků IZ

  

Ani průmyslové využití IZ se bohužel neobešlo bez několika významných katastrof, z nichž havárie v jaderné elektrárně v Černobylu je dozajista nejznámější katastrofou na světě (6, 7), následovanou havárií ve Fukušimě (8, 9). Přestože jiné havárie, např. v chemickém průmyslu (10), dokonce i tu černobylskou zastiňují jak zdravotními důsledky u přeživších, tak i počtem přímých obětí (11), skutečnost, že kontaminace rozsáhlých oblastí radionuklidy znamená jejich zamoření a neobyvatelnost ve velmi dlouhodobém horizontu, dává radiačním událostem specifický charakter. Mysterióznost IZ a psychické dopady radiačních katastrof navíc podporují skutečnost, že IZ nemůžeme vnímat žádnými smysly, a též přetrvávající nejistota ohledně zdravotních efektů nízkých expozic (12). A přestože přímé zdravotní dopady radioaktivního spadu z černobylské havárie byly v Evropě zanedbatelné (13, 14), nárůsty uměle ukončených těhotenství v mnoha evropských zemích ukazují, jak nebezpečná může být špatná informovanost obyvatelstva i zdravotních odborníků a z ní plynoucí obavy (15–18).

Ve výčtu expozičních situací potvrzujících důležitost radiobiologického výzkumu nesmíme opomenout ani ozáření následkem vdechování radonu. To představuje nejzásadnější zdroj ozáření člověka z přírodních zdrojů (19), navíc částicemi alfa, velmi nebezpečnými v případě vnitřní kontaminace (20, 21). Vdechování radonu je zajímavé hned z několika důvodů: a) představuje patrně nejčastější induktor maligních nádorů plic s výjimkou kouření (22), b) jedná se o jediný přirozený zdroj IZ, jehož příjem můžeme podstatným způsobem ovlivnit a c) poskytuje velmi cenná data pro velké populace lidí vystavené nízkým, přitom však různě vysokým dávkám IZ absorbovaným v dlouhodobém horizontu.

Abychom porozuměli rizikům radiační expozice, musíme nejprve pochopit, jakými mechanismy IZ působí na biologické systémy na různých úrovních komplexity, počínaje poškozením biomolekul (zejména DNA), biomolekulárních komplexů (chromatinu, biologických membrán apod.) a buněčných organel, buněk, tkání, orgánů, až konečně celého organismu a případně celých populací. Proto se podíváme na samotný počátek celého procesu, tj. stručně si nastíníme fyzikální a fyzikálně-chemické procesy, které IZ vyvolává v buňkách, a jak tyto procesy následně vedou k radiačnímu poškození DNA/chromatinu. Uvedené poznatky pomohou pochopit účinky IZ na vyšších úrovních komplexity (23, 24), rozdíly mezi deterministickými a stochastickými účinky (20), a proč mají jednotlivé typy IZ různou biologickou účinnost z hlediska poškození lidského zdraví nebo naopak likvidace nádorových buněk (20, 21).

MEDICÍNSKÉ NÁSLEDKY OZÁŘENÍ –⁠ DETERMINISTICKÉ A STOCHASTICKÉ ÚČINKY IZ

Z medicínského hlediska lze účinky IZ rozdělit na 2 základní kategorie (20, 21) –⁠ deterministické (neboli tkáňové) účinky (25) a účinky stochastické (neboli pravděpodobnostní) (26). V prvním případě se jedná o akutní nebo i pozdní (chronické) syndromy vyvolané vysokými (tj. nadprahovými) dávkami IZ nebo opakovanými expozicemi dávkám nižším. Deterministické účinky jsou tedy zapříčiněny úmrtím většího množství buněk, než je daná tkáň schopna nahradit. Citlivost buněk k IZ a repopulační schopnost tkáně určují prahovou dávku. Příkladem může být akutní radiační syndrom (ARS) (7) nebo radiační dermatitida (27).

Stochastické účinky (20, 21) (tab. 1) jsou z principu pouze pozdní a u ozářeného jedince se mohou objevit s určitou pravděpodobností, která roste s dávkou IZ. Dochází k nim následkem náhodného, a tudíž předem nepředvídatelného poškození genetické informace po expozici v principu jakékoliv dávce. U ozářených jedinců totiž nemůžeme předpovědět ani a) které buňky budou IZ zasaženy, ani b) která místa v genomu budou poškozena, ani c) výsledek reparace DNA v tom kterém místě poškození, natož pak d) odpověď organismu na vyšších úrovních komplexity (např. eliminaci poškozených buněk imunitním systémem). Výskyt stochastických účinků se proto omezuje jen na určitou část ozářených, danou velikostí dávky, přičemž ale nelze určit předem, u kterých konkrétních jedinců k projevu dojde. Jinak řečeno, riziko manifestace stochastických účinků u konkrétního jedince statisticky roste s absorbovanou (efektivní) dávkou. „Paradoxně“ se však může stát, že mnohem více ozářený jedinec, u kterého se dokonce rozvinuly účinky deterministické (viz níže), zůstane s ohledem na stochastické účinky celý život nepostižen, zatímco u mnohem méně ozářeného jedince k jejich manifestaci dojde. Klinická závažnost stochastických účinků, např. radiačně vyvolaného nádoru, přitom na absorbované (efektivní) dávce IZ nezáleží. Záleží pouze na typu a vlastnostech vytvořeného nádoru, což je ovšem opět otázkou náhody.

Všechny tyto nejistoty ohledně budoucího osudu ozářených, plynoucí z náhodného poškození DNA v jednotlivých buňkách, jsou živným podhoubím pro obvykle až přemrštěnou hrůzu ze záření. Na druhou stranu se zejména v USA stávají stále populárnější preventivní celotělová vyšetření pomocí výpočetní tomografie (CT). Jako by se při medicínském použití IZ stírala jakákoliv rizika. Riziko iniciace malignity po CT přitom nelze považovat za zcela ignorovatelné a v každém případě mnohonásobně převyšuje benefit vyšetření, vezmeme-li v potaz jeho pouze preventivní charakter.

Podle v současnosti akceptovaného lineárního bezprahového modelu (LNT) (28, 29) považujeme stochastické účinky s ohledem na dávku IZ, která je může vyvolat, za bezprahové. Existuje však řada indicií, že stochastické účinky, obdobně jako účinky deterministické, bezprahové nejsou. Závislost pravděpodobnosti výskytu stochastických účinků na dávce IZ v oblasti velmi nízkých dávek přitom může být i poměrně složitá (23) (obr. 2).

  

Obr. 2  Různé možnosti závislosti biologických účinků ionizujícího záření na absorbované (efektivní) dávce:
Stochastické efekty –⁠ křivky 1 až 6: V případě stochastických účinků s dávkou roste počet jedinců v ozářené populaci, u kterých se efekt vyskytne; závažnost efektu s dávkou neroste. Křivka 1 –⁠ lineární model bez prahové dávky (LNT); tečkovaná oblast křivky vyjadřuje data extrapolovaná z dat pro vyšší dávky a vysoké dávkové příkony. Křivka 2 –⁠ dvě různé varianty hypersenzitivní závislosti (supralineární závislost). Křivka 3 –⁠ hyposenzitivní (sublineární závislost). Křivka 4 –⁠ lineární (případně lineárně-kvadratická) závislost s prahovou dávkou. Křivka 5 –⁠ hormezní efekt v oblasti (velmi) nízkých dávek následovaný lineární závislostí s prahovou dávkou. Křivka 6 –⁠ komplexnější závislost s hypersenzitivitou v oblasti velmi nízkých dávek přecházející v hormezi u vyšších nízkých dávek a posléze lineární závislost s prahem.
Deterministické efekty –⁠ křivka 7: Efekt se od určité prahové dávky (např. cca. 0,6 Sv pro ARS) projevuje u všech jedinců ozářených nadprahovou dávkou, přičemž závažnost efektu (nikoliv jeho pravděpodobnosti) sigmoidálně roste se stoupající dávkou.
   

  

Do kategorie stochastických účinků patří vznik nádorů (poškození somatických buněk) a vrozených vývojových vad (poškození gamet) (20, 21). Je však nutno podotknout, že účinkům (velmi) nízkých dávek IZ zatím ne zcela rozumíme (28, 30–33). Dokonce ani v případě černobylských likvidátorů exponovaných vysokým dávkám IZ se doposud nepodařilo v následujících generacích jednoznačně prokázat transgenerační dopad této expozice na genetický materiál (34), přestože některé studie naznačují zvýšený počet mutací a různé adaptační změny v genomu zástupců různých organismů dlouhodobě vystavených zvýšeným dávkám IZ v „exkluzivní zóně“ kolem Černobylu (35–37). Stejné pozitivní překvapení přineslo i monitorování frekvence vrozených vývojových vad u potomků přeživších atomového bombardování v Hirošimě a Nagasaki. I v těchto výzkumech očekávané hodnoty výrazně převyšovaly realitu (38). Dle některých studií vedla expozice nízkým dávkám IZ následkem exploze atomových bomb naopak k prodloužení věku dožití a nižší úmrtnosti na rakovinu ve srovnání s neozářenou populací (39). Kvantifikování rizika stochastických účinků na dávce IZ zůstává z hlediska radiační ochrany i nadále velmi problematické. Zejména proto, že incidence nádorů v populaci je obecně velmi vysoká a velice malý potenciální nárůst vyvolaný (velice) nízkými dávkami IZ obvykle nedosahuje statistické významnosti. Nádory indukované IZ nelze totiž klinicky od „neradiačních“ nádorů nijak odlišit. Některé studie nicméně nabízejí určitou naději do budoucna, poukazujíce na –⁠ do jisté míry specifické –⁠ genové expresní profily u nádorů indukovaných IZ (40–43). Obecně ale platí, že stochastické zdravotní defekty po expozici IZ mají stejný klinický projev jako korespondující klinické jednotky vzniknuvší z neradiačních příčin (20, 21).

O stochastických účincích mluvíme jako o účincích nízkých dávek IZ, a to z prostého důvodu –⁠ v této oblasti dávek nemůže IZ jiné než stochastické účinky způsobit. Mějme však na paměti, že riziko výskytu stochastických účinků roste s dávkou bez omezení. Pro dávky střední a vysoké, které si naopak spojujeme s účinky deterministickými, je tak dokonce významně vyšší než pro dávky nízké. Rozdíl mezi stochastickými a deterministickými účinky v oblasti vysokých dávek spočívá mj. v tom, že zatímco deterministické účinky postihnou všechny jedince vystavené nadprahové dávce (viz níže), stochastické účinky si zachovávají statistický charakter a projeví se pouze u určité proporce ozářené populace, která odpovídá velikosti dávky.

Pro deterministické účinky (tab. 1) je naopak charakteristické, že se objevují až po překročení určité prahové dávky IZ, přičemž mohou být akutní nebo pozdní (chronické). Velikost prahové dávky závisí na konkrétním efektu, postižené tkáni a charakteru expozice –⁠ zejména je důležité, zda se jedná o expozici jednorázovou nebo protrahovanou. Pro jednorázové (akutní) ozáření jsou prahové dávky mnohem nižší než pro expozici opakovanou, chronickou (20, 21). Typ deterministického účinku pak závisí (na rozdíl od stochastických účinků) na místě a rozsahu ozáření (celotělové vs. částečné). Dalším rozdílem proti stochastickým účinkům IZ je závislost závažnosti efektu, tedy například klinických projevů ARS, na absorbované dávce IZ. Tato závislost má sigmoidní průběh a začíná až od již zmíněné prahové dávky. Závislost mezi dávkou IZ a klinickou závažností deterministického efektu je pro různé typy účinků již dobře známá díky tomu, že oběti postižené deterministickými efekty IZ lze podle klinického obrazu jednoznačně identifikovat a podrobně vyšetřit a výsledky korelovat se změřenou a nebo alespoň odhadnutou dávkou (20, 21). Stručně shrnuto, u stochastických účinků stoupá s dávkou počet postižených v rámci ozářené populace, závažnost případného postižení je ale nezávislá na dávce. Deterministické účinky se naopak objevují až po překročení prahové dávky, zato však u všech jedinců vystavených této dávce (pokud opomineme určité rozdíly plynoucí z individuální radiosenzitivity) (20, 21). S rostoucí dávkou stoupá nikoliv pravděpodobnost, ale závažnost deterministických účinků.

  

Tab. 1  Srovnání stochastických a deterministických účinků IZ

Charakteristika	Stochastické účinky	Deterministické účinky
Příklad	nádory, vrozené vývojové vady	ARS, radiační dermatitida
Příčina	mutace DNA	poškození DNA neslučitelné se životem buňky,  smrt většího množství buněk,  než je tkáň schopna nahradit repopulací
Výskyt po expozici dávkám IZ	vysokým i nízkým	pouze vysokým
Existence prahové dávky	ne (?)	ano
S dávkou roste	frekvence výskytu; individuální riziko	závažnost klinických projevů
Závislost frekvence výskytu na dávce	lineární bezprahová (v oblasti nízkých dávek možné i jiné závislosti –⁠ hypersenzitivita, hyposenzitivita, hormeze, komplikovanější závislosti kombinující dříve uvedené)	od prahové dávky 100 % (bez zohlednění určitých rozdílů prahové dávky v závislosti na individuální radiosenzitivitě)
Závislost závažnosti klinických projevů na dávce	ne	sigmoidní
Závažnost efektu	ano vs. ne; pokud se projeví pak: somatické efekty (nádory; mohou být vyléčeny nebo skončit smrtí; genetické efekty (vrozené vývojové vady; neléčitelné,  různý stupeň mentálního a fyzického postižení  dle konkrétního genetického defektu)	široká škála od mírných projevů až po smrt
Doba latence	velice dlouhá –⁠ pouze pozdní manifestace: roky (leukémie) až desetiletí (solidní nádory) po ozáření	akutní syndromy: desítky minut až dny či týdny; pozdní syndromy: měsíce, spíše roky
Závislost doby latence na dávce	ne	ano
Odlišitelnost projevů na základě klinické manifestace	ne	ano
Možnost postižení potomstva	ano, v případě postižení gamet	ne
Možnost výskytu v neozářených oblastech těla	ano	ne

  

RŮZNÉ TYPY IZ A JEJICH FYZIKÁLNÍ CHARAKTERISTIKY, BIOLOGICKÁ ÚČINNOST A VYUŽITÍ V RADIOTERAPII

Nyní se již podívejme na mechanismy, jakými IZ stochastické a deterministické účinky vyvolává. Hned na začátku je třeba zdůraznit, že v různých expozičních situacích se setkáváme s různými typy IZ, které jsou z hlediska radiační ochrany i hlediska zdravotního různě nebezpečné. V případě výbuchu atomové bomby bude člověk vystaven kombinaci velmi intenzívního záření gama a neutronů uvolněných během samotné exploze (initial radiation) a následně i kombinaci dalších typů záření (alfa, beta, gama) emitovaných radioaktivními produkty jaderné reakce tvořícími radioaktivní spad (residual nuclear radiation) (44, 45). Neutrony mohou navíc aktivovat i některé okolní materiály (46), které se samy stávají zdroji ozáření. Ve vesmíru pak budou zejména posádky meziplanetárních letů (pronikající mimo ochranné magnetické pole Země) čelit komplexnímu mixu energetických fotonů gama[1], protonů, částic alfa a nejrůznějších urychlených iontů, na rozdíl od předcházejícího scénáře však obvykle absorbovaných s nízkým dávkovým příkonem (47). Přesto lze očekávat, že astronauti během cesty na Mars a zpět nakumulují celkovou dávku asi 1–2 Gy (4), což odpovídá dávce z externího ozáření, kterou byli zasaženi méně exponovaní první likvidátoři havárie v Černobylu[2] (48). Ti však tuto dávku absorbovali během krátkého časového okamžiku formou jednorázové akutní expozice, což u nich vedlo k rozvoji akutní nemoci z ozáření (též známé jako akutní radiační syndrom) (7). V radioterapii se pak kromě „klasické“ terapie fotonovým zářením (1) stává stále běžnější ozařování protony (49, 50), přičemž své uplatnění nacházejí i urychlené (uhlíkové) ionty (50), byť vzhledem k technické a finanční náročnosti zatím výrazně vzácněji.

Rozdíl v biologických účincích různých typů IZ plyne z jejich různých fyzikálních vlastností, a tudíž i mechanismů, jimiž interagují s biomolekulami a buňkami. Přeskočíme-li zde skoro až filozofickou debatu o duální vlnově-částicové povaze objektů mikrosvěta, můžeme z hlediska fyzikálních interakcí s hmotou i biologických účinků IZ primárně rozdělit na 2 typy –⁠ fotonové a částicové (20, 21).

Fotonová záření dělíme na záření rentgenové a záření gama, a to obvykle na základě mechanismu jejich vzniku. Jako rentgenové záření (v anglosaské literatuře X-rays) obvykle označujeme fotony vznikající v elektronovém obalu atomů bombardovaných urychlenými elektrony. Elektrony prolétávající elektronovým obalem atomů terčového materiálu předávají svou energii elektronům v obalu, čímž dochází k přeskoku takto excitovaných elektronů na vyšší energetické hladiny. Následně elektrony padají zpět na nižší energetické hladiny (deexcitace), přičemž uvolněná energie je vyzářena ve formě fotonů tzv. specifického rentgenového záření. Zároveň vzniká tzv. brzdné rentgenové záření, a to následkem změny dráhy elektronů prolétávajících elektronovým obalem atomů terčového materiálu. Budiž jen zdůrazněno, že brzdné rentgenové záření mohou kromě elektronů generovat více či méně efektivně všechny nabité částice. Záření gama je pak emitováno rozpadajícími se atomovými jádry nestabilních radioizotopů (20, 21).[3] Fotony mají obecně nulovou klidovou hmotnost a pohybují se rychlostí světla. Vzhledem k těmto vlastnostem ionizují okolní prostředí jen nepřímo (nulový náboj) a „řídce“ (vysoká rychlost šíření), což se odráží v jejich vysoké schopnosti penetrovat prostředím (vzduchem i biologickými tkáněmi), a naopak nižší schopnosti poškozovat buňky v porovnání s urychlenými částicemi (51).

Energické částice můžeme rozdělit do 2 základních kategorií –⁠ nabité a nenabité. Nabité částice dále kategorizujeme na lehké a těžké. Mezi lehké nabité částice obvykle řadíme urychlené elektrony, pozitrony a protony. Těžké nabité částice pak reprezentují zejména částice alfa a urychlené těžké ionty[4] (52). Nenabité částice reprezentují pouze neutrony (opomineme-li zde neutrina, kterým se zde věnovat nebudeme pro jejich nulový význam s ohledem na lidské zdraví).

Neutronové záření představuje specifickou skupinu, jelikož svými unikátními vlastnostmi v některých ohledech připomíná spíše fotonové záření, v jiných ohledech naopak proudy těžkých nabitých částic. Energetické neutrony tvoří významnou složku ionizujícího záření produkovaného atomovými zbraněmi a také jadernými reaktory (53). Neutrony jsou také spolu s protony, částicemi alfa, urychlenými ionty a fotony gama součástí primárního kosmického záření (54). Neutrony lze z našeho pohledu považovat za částice, na rozdíl od urychlených nabitých částic však nenesou náboj. Neutrony tudíž mohou interagovat pouze s jádry okolních atomů a okolní prostředí ionizují pouze nepřímo. I přes svou nenulovou hmotnost tak velmi snadno pronikají hmotou jako fotony a fotonům se podobají i profilem hloubkové depozice energie (55). Přesto mohou v závislosti na energii vykazovat i značně vysoké hodnoty relativní biologické účinnosti (RBU, w_R)[5], kterými dostihují i částice alfa a těžké ionty (tab. 2). Nejnebezpečnější jsou neutrony s energií 100 keV až 2 MeV, známé jako „rychlé neutrony“, které mohou být až 20× nebezpečnější než fotonové záření (56, 57). Nebezpečnost neutronů v tomto energetickém rozsahu je dána rozporem mezi energií již dostatečně vysokou k efektivním interakcím s okolní hmotou a energií příliš vysokou, doprovázenou nadměrnou rychlostí neutronů, která efektivitu interakcí výrazně snižuje. Schopnost neutronů interagovat přímo s atomovými jádry se zároveň pojí s výraznou schopností aktivovat okolní materiály. Tyto materiály se pak samy stávají zdrojem IZ, na což musí být pamatováno např. při stínění a například i výrobě jaderných reaktorů (46).

Urychlené nabité částice (59) svým nábojem ionizují okolní prostředí přímo a pohybují se –⁠ vzhledem ke své hmotnosti –⁠ pomaleji než energetické fotony. Hustota ionizací, definovaná jako lineární přenos energie (LPT či LET)[6], logicky silně závisí na náboji a rychlosti částice. Rychlost částice je přitom daná její hmotností a energií, ale i již zmíněným nábojem a dalšími faktory, např. typem prostředí. Nabité částice v důsledku interakce vyplývající z jejich elektrického náboje předávají při průchodu prostředím (tkání) svou energii okolí s jiným hloubkovým profilem než záření fotonová a neutrony (59). Tuto depozici energie jako funkci hloubky materiálu (tkáně) popisují tzv. křivky hloubkové dávky[7] (21), znázorněné na obr. 3. Ze srovnání těchto křivek pro různé typy záření je patrné, že energické fotony předávají nejvíce energie na povrchu tkáně, zatímco nabité částice naopak až v určité hloubce tkáně, která je dána energií a dalšími parametry částice. Zatímco energie fotonů při průchodu tkání příliš neklesá, nabité částice jsou tkání silně zpomalovány až do zastavení. S hloubkou penetrace tak roste LPT částice, až se nakonec nejvíce energie uvolní těsně před koncem její dráhy letu, v oblasti tzv. Braggova maxima (Bragg peak) (21). Jinými slovy, ve srovnání s fotonovým zářením je možné –⁠ volbou vhodné energie částic –⁠ zacílit depozici energie mnohem přesněji právě jen do objemu nádoru. Tkáň před Braggovým maximem, a zejména za ním, je tak oproti oblasti Braggova maxima ozářena výrazně méně, čehož lze s výhodou využít u některých typů nádorů, zejména těch lokalizovaných v blízkosti kriticky důležitých orgánů a jejich struktur (obr. 3) (20, 21). V klinické praxi se dá energetické spektrum monoenergetického svazku částic rozptýlit tak, aby různé částice vykazovaly Braggovo maximum v různé hloubce tkáně. Vzniká tak tzv. rozšířené Braggovo maximum (spread-out Bragg peak), jež svým hloubkovým rozsahem přesně pokrývá objem nádoru (obr. 3) (62).

  

Obr. 3  Závislost depozice energie záření na hloubce ve tkáni (vodě) pro příklady fotonového záření a protonového záření (87).
Pro protonové záření je ukázána depozice energie pro monoenergetický svazek a pro svazek, kde jsou energie protonů filtrovány tak, aby došlo k „rozmazání“ polohy Braggova maxima do hloubkového úseku korelujícího s pozicí tumoru; vzniká tak tzv. SOBP (spread-out Bragg peak), čímž se celý objem nádoru nachází přesně v oblasti maximálního předání energie IZ. Díky tomu, že protony jsou nabité částice a vykazují depozici energie s Braggovým maximem, zdravá tkáň před nádorem absorbuje pouze asi 30 % energie protonů a zdravá tkáň za nádorem není ozářena téměř vůbec, zatímco do objemu nádoru je předáno cca 70 % energie. To umožňuje výraznou ochranu životně důležitých tkání a vitálních struktur v těsné blízkosti nádoru, např. oka v případě mozkových nádorů, střeva v případě nádorů prostaty atd.  

   

Protony a elektrony jsou lehčí než neutrony, nesou však náboj. I když je náboj a hmotnost těchto lehkých nabitých částic výrazně menší ve srovnání s těžkými nabitými částicemi, odpovídá charakter hloubkové depozice energie urychleným těžkým iontům (obr. 3), hustota ionizací je však relativně nízká, takže w_R a RBU se příliš neliší od fotonových záření (tab. 2). V současnosti se rozvíjející protonová terapie tudíž nabízí ve srovnání se standardní fotonovou radioterapií přesnější zacílení energie záření do objemu nádoru a ochranu okolní tkáně, účinnost zabíjení nádorových buněk ovšem není výrazně větší (59).

  

Tab. 2  Radiační váhové faktory (wR) pro základní typy záření (58)

Typ záření	Energie	Radiační váhový faktor (wR)
fotony (záření gama, rentgenové záření)	všechny energie	1
elektrony, miony	všechny energie	1
neutrony	< 10 keV	5
	10–100 keV	10
	> 100 keV –⁠ 2 MeV	20
	2–20 MeV	10
	> 20 MeV	5
protony (kromě rozptýlených /recoil/)	> 2 MeV	2 nebo 5 (dle zdroje)
částice alfa, štěpné fragmenty, urychlené těžké ionty	všechny energie	20

  

Těžké nabité částice jsou v důsledku své hmotnosti a náboji při průchodu prostředím intenzivně brzděny, což se projevuje jednak již zmíněným profilem hloubkové depozice dávky, jednak vysokou a postupně vzrůstající hustotou ionizací podél jejich dráhy letu (tj. LPT). Stejně jako lehké nabité částice nabízejí i těžké nabité částice přesnější zacílení dávky záření do nádoru[8], oproti lehkým částicím a fotonům ale způsobují mnohem závažnější poškození buněk a tkáně (59, 63). Obou těchto vlastností cíleně využívá rozvíjející se hadronová terapie pomocí uhlíkových a případně dalších iontů (59, 63). Čtenáře zajisté nepřekvapí, že různé typy nenádorových buněk i buňky různých nádorů reagují na ozáření různě –⁠ některé jsou velmi senzitivní, jako např. lymfocyty (64), jiné zase velmi radiorezistentní, např. neurony a glioblastomové buňky (65, 66). Radiosenzitivita či naopak radiorezistence buněk přitom záleží na mnoha faktorech, mj. na rychlosti jejich proliferace (1, 67). Na korelaci mezi proliferační rychlostí buněk a jejich radiosenzitivitou (Bergoniého a Tribondeauův zákon) (21) byl založen i prvotní nápad využití IZ k eliminaci nádorů (1, 21, 67), přestože již brzy po objevu IZ vešlo ve všeobecnou známost, že IZ poškozuje nejen buňky nádorové, ale i normální. Předpokládalo se, že nádorové buňky budou k radioterapii výrazně citlivější v důsledku své rychlé proliferace. Bohužel se však často ukázal pravý opak, a sice, že nádorové buňky reagují na ozařování rezistentněji než buňky normální. Tato skutečnost činila a činí radioterapii v řadě případů nemožnou (1, 20, 21, 68).

Podotkněme, že korelace mezi radiosenzitivitou buněk a rychlostí proliferace není absolutní ani pro nenádorové buňky, jelikož existuje řada výjimek z tohoto pravidla, kdy jsou rychleji se dělící buňky k záření odolnější (69). Radiorezistentní mohou být již buňky (pre)nádorové, které následkem genetických změn zvyšují oproti svým zdravým „prekurzorům“ rychlost dělení, přičemž ale zároveň získávají schopnost radiačně vyvolané poškození DNA efektivněji opravovat (70). Zvýšená reparační kapacita však může být vykoupena nižší přesností oprav. Úspěšná, avšak nepřesná reparace zlepšuje šanci ozářených buněk přežít, zároveň však zvyšuje rychlost kumulace mutací v genomu přeživších buněk (71). Mnoho nádorových buněk v důsledku své vysoké mutability naopak trpí významnými defekty v reparačních drahách (72). Paradoxně i tyto buňky mohou být radiorezistentní, vyvinou-li si schopnost tolerovat dvouřetězcové zlomy (DSB) a případně i jiná poškození DNA (73). Inherentní radiorezistence buněk je tudíž z velké části dána nejen rychlostí proliferace, ale i jejich schopností reparovat poškozenou DNA (69, 71, 74–76), iniciovat apoptózu (77, 78), regulovat kontrolní body buněčného cyklu po poškození DNA (79) atd. (1, 20, 21, 80). Nezanedbatelnou úlohu hrají i epigenetické modifikace chromatinu a jeho architektura (75, 80–86), kterým se budeme ještě obšírněji věnovat v následujícím textu.

MECHANISMY RADIAČNÍHO POŠKOZENÍ DNA/CHROMATINU

Schopnost IZ zabíjet buňky a vyvolávat různé akutní i pozdní syndromy, včetně nádorového bujení, byla pozorována velmi brzy po objevu rtg záření Wilhelmem Konradem Röntgenem v roce 1895 (21). Zodpovězení otázek, proč ozářené buňky vlastně umírají, jak radiační poškození vede k nádorům, a jak ho naopak co nejlépe využít k jejich eliminaci, od té doby představuje stěžejní náplň radiobiologického výzkumu. Pokud se na biologické dopady ozáření podíváme z energetického hlediska, překvapivě zjistíme, že energie 1 Gy záření předaná tkáni je tak malá, že odpovídá přibližně energii získané vypitím jednoho šálku espressa (20). I takto malá dávka však již přesahuje prahovou dávku (přibližně 0,6 Gy) pro vyvolání hematopoetické formy ARS (20). S dávkou 10× vyšší, tedy 10 Gy, se již dostáváme do oblasti dávek z hlediska dopadů na lidské zdraví tak vysokých, že neexistují žádní jedinci, kteří by takovouto jednorázovou celotělovou expozici přežili. Dávka 10 Gy z definice odpovídá 10 J/kg, což pro průměrně těžkého (80 kg) člověka znamená absorpci 800 J. Pro srovnání, k ohřátí 1 l vody o 1 °C bychom potřebovali 4184 J, tj. energii zhruba 4× vyšší. Dávka 10 Gy tedy člověka spolehlivě zabije, přitom ale zvýší teplotu jeho těla o pouhých 0,002 °C (20). Samotná velikost energie předané zářením tkáni tedy nevysvětluje schopnost IZ efektivně zabíjet buňky.

Důležitou úlohu proto zjevně hraje i způsob, jakým k předání energie dochází, přičemž je zřejmé, že v buňkách musí existovat nějaký kritický cíl, jež je k účinkům IZ obzvláště citlivý. Dnes je obecně akceptován názor, že tímto cílem je DNA v buněčném jádře (20, 21), přestože existují i studie s různými bakteriálními kmeny, poukazující na dokonce dominantní roli narušení funkce proteinů zajišťujících eliminaci reaktivních forem kyslíku (ROS) (88). IZ vyvolává v DNA řadu různých lézí (obr. 4), z nichž nejnebezpečnější typ představují DSB (20, 21). Teoreticky i 1 DSB může způsobit smrt buňky, zůstane-li neopraven, případně zapříčinit nádorovou transformaci buňky, je-li opraven nesprávně. DSB vznikají působením různých environmentálních i nitrobuněčných faktorů, IZ je však jejich nejefektivnějším induktorem (20, 21).

  

Obr. 4  Různé typy poškození DNA vznikající následkem expozice IZ (případně dalším exogenním i endogenním stresorům):
1. Cyklobutanové pyrimidinové (zejména thyminové) dimery, vznikající působením (neionizujícího) UV záření
2. Oxidace a další typy poškození bází; zobrazena oxidace deoxyguanosinu (dG) na 8-oxo-2'-deoxyguanosin (8-oxo-dG)
3. Intra -⁠ a 4. interřetězcové crosslinky (v detailu zobrazeno vytvoření crosslinku mezi deoxythymidinem a deoxyadenosinem)
5. Jednořetězcové zlomy DNA (SSB)
6. Dvouřetězcové zlomy DNA (DSB)
7. Depurinace a depyrimidinace vedoucí ke vzniku abazických (AP) míst
8. Proteinové a jiné objemné adukty na DNA
9. Nesprávné párování nukleotidů (misrepair) vedoucí navíc k distorzi struktury dvoušroubovice DNA

     

Nebezpečnost DSB spočívá v tom, že přerušují oba řetězce molekuly DNA zároveň a ve stejném místě, čímž ji zcela dezintegrují. Nejsou-li vzniknuvší volné konce DNA včas spojeny pomocí reparačních mechanismů, může dojít k jejich oddálení a nesprávnému spojení, ať už s konci pocházejícími z jiných chromosomů nebo nesprávných oblastí chromosomu stejného. Vznikají tak chromosomové translokace a další aberace (20, 21, 89). Frekvence translokací, dicentrických chromosomů a kruhových chromosomů koreluje s absorbovanou dávkou IZ, což tyto aberace staví do role důležitých biomarkerů pro odhad absorbované dávky, užitečných zejména v případě radiačních havarijních situací většího rozsahu, kdy obvykle nejsou k dispozici přesnější dozimetrické údaje (20, 21, 89).

Nebezpečnost DSB indukovaných IZ však vyplývá i z dalších faktů: Ionizující záření vytváří zlomy komplexní a mnohočetné, často ve vzájemné kombinaci (60, 90, 91). Za komplexní DSB považujeme takové léze, kde DSB prostorově kolokalizují s nějakým jiným typem poškození DNA, např. oxidativním poškozením bází. Mnohočetné DSB jsou pak takové léze, kde je více DSB klastrováno v molekule DNA v těsné vzájemné blízkosti (20, 21), což může vést i k lokální fragmentaci chromatinu (obdobně jako chromotripsis spojená např. s myelodysplastickými syndromy) (obr. 5) (92, 93). Komplexní a mnohočetné DSB mohou být opraveny jen s obtížemi nebo je nelze opravit vůbec (60, 91, 94), jak již bylo zmíněno. Proto tyto léze považujeme z hlediska biologických účinků IZ za kritické, rozhodující o osudu ozářené buňky (59, 95–97). DSB vytvořené IZ navíc nemohou být obvykle spojeny bez předchozího enzymatického „začištění“ konců DNA, což –⁠ v závislosti na reparačním mechanismu –⁠ končí vznikem malých nebo i rozsáhlých delecí v místech DSB (98, 99).

IZ vytváří DSB dvěma mechanismy –⁠ přímým a nepřímým. Brzy po objevu IZ bylo pozorováno, že buňky v hypoxickém prostředí přežívají při dané dávce IZ mnohem lépe než buňky za normoxických podmínek (100). I dnes hypoxie velice často komplikuje radioterapii, nebo ji dokonce znemožňuje, protože činí nádorové buňky mnohem odolnější k IZ oproti buňkám nenádorovým (a to i přes vyšší rychlost proliferace nádorových buněk) (100). Tato zjištění nasměrovala pozornost vědců k úloze ROS v mechanismu radiačního poškození DNA (21). ROS vznikají radiolýzou vody obsažené v buňkách a při kontaktu s DNA molekulou v ní generují jednořetězcové zlomy (SSB) (20, 21). K vytvoření DSB je tudíž zapotřebí ataku dvou ROS v těsné vzájemné blízkosti na komplementárních řetězcích molekuly DNA, což však není vzhledem k množství vytvořených ROS nijak ojedinělé. Tímto mechanismem poškozují DNA zejména fotonová záření (20, 21), kde nepřímý účinek přispívá k celkovému poškození DNA přibližně 70–80 % (101).

V případě těžkých nabitých částic poškozuje molekulu DNA naopak především samotná prolétávající částice (20, 21). Tento mechanismus nazýváme přímým účinkem IZ. Smrtící efekt tohoto typu IZ proto ve srovnání s fotonovým zářením mnohem méně závisí na ROS, a tudíž i saturaci tkáně kyslíkem (21, 102). DSB může navíc vzniknout už průletem jediné částice, na rozdíl od nepřímého účinku IZ, který vyžaduje současný útok dvou ROS v daném místě DNA. Radioterapie pomocí urychlených těžkých iontů může být proto účinná i v případě hypoxických nádorů (100, 103, 104), kterých je většina. Smrtící schopnost hustě ionizujících částic je zároveň méně ovlivněna genetickým pozadím nádorových buněk, například funkčností proteinu p53 (105).

REPARACE DSB A BIOLOGICKÉ ÚČINKY IZ

Homologní rekombinace (HR) (106) a nehomologní spojování konců (NHEJ) (107) představují 2 základní mechanismy reparace DSB v eukaryotických buňkách.

NHEJ je rychlý reparační mechanismus, kterým jsou volné konce DNA po jejich enzymatickém začištění jednoduše spojeny. Je proto velmi účinným a nezastupitelným reparačním mechanismem zejména v buňkách s rozsáhlými genomy, kde je rychlé znovuspojení potenciálně velkého množství DSB nezbytné pro zabránění vzniku nebezpečných translokací a neopravených DSB, často vedoucích k smrti buňky během mitózy. V lidských buňkách tvoří kódující sekvence DNA pouze asi 2 % genomu (108) a jen část těchto sekvencí přímo či nepřímo ovlivňuje rovnováhu buněčné proliferace. Nespojené DSB nebo chromosomální aberace mohou zabránit buňce vstoupit do mitózy nebo v mitóze správně separovat genetický materiál (chromosomy). Později zmíněná situace je obvykle příčinou tzv. mitotické smrti, což je nečastější typ smrti buněk exponovaných IZ. Alternativně mohou ozářené buňky s neopravenými DSB přejít do senescence (109), případně přežít v cyklujícím stavu s nestabilním genomem v důsledku polyploidizace (109, 110). Polyploidní buňky jsou geneticky velmi nestabilní a představují značné riziko iniciace nových (radiorezistentních) klonů nádorových buněk (109). O senescentních buňkách se naopak donedávna myslelo, že představují bezpečně inaktivované buňky. Ukázalo se však, že za určitých okolností mohou i senescentní buňky začít znovu proliferovat, a představují tudíž v organismu jakousi genetickou časovanou bombu (111). NHEJ tak může buňku zachránit před smrtí a nádorovou transformací s relativně nízkým rizikem poškození kritických sekvencí genomu.

HR je svým mechanismem opakem NHEJ –⁠ jedná se o proces složitý a pomalý, který však v naprosté většině situací dokáže integritu DNA obnovit beze změny genetické informace (20, 21, 106). Specifické enzymy nejprve rozloží jeden řetězec dvouřetězcové molekuly DNA v dlouhých úsecích na obě strany od místa DSB. Tím se vytvoří jednořetězcové konce DNA, jež následně vyhledají homologické sekvence na sesterské chromatidě chromosomu, se kterou vytvoří triplexovou strukturu. Podle genetické informace zapsané v sekvenci nukleotidů neporušené chromatidy jsou dosyntetizovány chybějící úseky řetězců DNA, které jsou následně spojeny (20, 21, 106). HR tak umožňuje opravit i velmi složité DSB léze bez vzniku mutací, je však omezena víceméně pouze na pozdní fázi S a G2 buněčného cyklu (20, 21, 106). Existují však situace, kdy i HR může být mutagenní a nebezpečná (112, 113).

Jak se buňka rozhoduje, který reparační systém použije pro konkrétní DSB, není zatím úplně jasné (112). Každopádně je důležité zdůraznit, že radiační poškození DNA i její následná reparace neprobíhají na holé DNA, nýbrž v kontextu chromatinu (24, 112, 114–117), který v buněčném jádře vytváří strukturně a funkčně různé domény (118–120). Architektura chromatinu tak ovlivňuje odpověď buňky na ozáření na úrovni vzniku a charakteru poškození DNA (23, 60, 112, 115, 121), na úrovni výběru reparačního mechanismu (112, 117, 122) i na úrovni efektivity a přesnosti reparace (112, 123).

Reparace DSB je na mikroskopické úrovni spojena s akumulací reparačních proteinů v místech DSB, což vede k vytvoření reparačních komplexů, které mohou být vzhledem ke své velikosti vizualizovány např. pomocí fluorescenčně značených protilátek a imunofluorescenční konfokální mikroskopie (60, 112, 114) či superrozlišovací (75, 117, 124, 125) jako tzv. IRIF (ionizing radiation-induced foci) (obr. 5). Mikroskopie tudíž představuje ve výzkumu radiačního poškození a reparace DNA jednu ze stěžejních metod, protože umožňuje studovat tvorbu, distribuci a „rozpouštění“ IRIF v průběhu reparace v intaktních nebo i živých buňkách. Kromě rozsahu a charakteru iniciálního poškození DNA a kinetiky reparace mikroskopie poskytuje informace také o organizaci reparačních procesů v prostoru a čase, což je pro porozumění biologickým účinkům různých typů IZ nezbytné (60, 75, 112, 114, 116, 121, 124). Pro podrobnější informace o aplikacích mikroskopie a nanoskopie v radiobiologickém výzkumu a biodozimetrii a o současném vývoji v této oblasti si dovoluji čtenáře odkázat na přehledový článek již dříve publikovaný v tomto časopise (61). Nicméně zde vytkněme, že dnes se i s optickou mikroskopií dostáváme na rozlišovací úroveň jednotlivých molekul (např. jednomolekulová lokalizační mikroskopie /SMLM/ (75, 117, 124, 125), což nám dovoluje studovat organizaci IRIF a reparačních procesů DSB na nanoúrovni.

  

Obr. 5  Účinky fotonového (vlevo) a hustě ionizujícího záření (vpravo) (60, 61).
Modrá barva představuje chromatin (tj. buněčné jádro), červená a zelená potom dva nezávislé markery (viz níže) dvouřetězcových zlomů DNA (DSB). DSB představují nejzávažnější typ poškození molekuly DNA. Zelené signály na levém jádře a červené na pravém (střední panel) představují ohniska gH2AX, tj. místa fosforylace histonu H2AX na ser 139 v místech DSB. Červené signály na levém jádře odpovídají proteinu MRE11, který stojí na začátku reparace DSB pomocí reparačních mechanismů NHEJ i HR. Zelený signál na pravém jádře vizualizuje ohniska reparačního proteinu RAD51, který účinkuje později v reparaci DSB, a to specificky v místech DSB reparovaných prostřednictvím HR.
Levé jádro: Maximální obraz vytvořený superpozicí jednotlivých konfokálních řezů jádrem lidského kožního fibroblastu ozářeného 1 Gy záření gama (⁶⁰Co, 1 Gy/min) a zobrazeného pomocí imunofluorescenční konfokální mikroskopie 1 hod. po ozáření. Viditelných je cca 21 ohnisek gH2AX, povětšinou kolokalizujících s ohnisky proteinu MRE11 a prostorově vzájemně separovaných.
Pravé jádro: Totéž jako levé jádro, avšak ozářené těžkými nabitými ionty (¹⁵N) o LET 180 keV/mm¹ a energii 13,1 MeV/nukleon při zachování stejné dávky. Většina ohnisek gH2AX a RAD51 je nakumulována podél 6 lineárních trajektorií odpovídajících drahám průletu 6 iontů ¹⁵N. Ohniska gH2AX a RAD51 zde vytvářejí komplexní klastry poukazující na tvorbu komplexních a mnohonásobných DSB, což jsou léze, které buňka dokáže opravit jen obtížně; často jsou tak pro ni smrtelné. Ohniska gH2AX a RAD51 vyskytující se mimo lineární trajektorie průletových kanálů částic označují místa DSB lézí vytvořených sekundárními (delta) elektrony vyraženými z atomů prostředí primárním prolétávajícím iontem. Distribuce těchto ohnisek (tedy trajektorie a dolet delta elektronů) závisí na fyzikálních charakteristikách daného ionizujícího záření.

       

Jedním z prvních kroků reparace DSB je fosforylace histonů H2AX na serinu 139 v rozsáhlé oblasti chromatinu (u člověka až 2 Mb) kolem zlomu DNA (126). Takto fosforylovaný histon, zvaný gH2AX, slouží jednak jako signál DSB, jednak napomáhá přenastavit strukturu chromatinu do konfigurace potřebné pro reparaci a umožňuje koordinovanou vazbu řady proteinů do místa poškození (127, 128). Některé z těchto proteinů se podílejí na všech reparačních mechanismech (drahách), jiné jsou specifické jen pro určitý mechanismus. Reprezentantem „univerzálního“ reparačního proteinu je např. protein 53BP1 (99, 129), který se uplatňuje jak při NHEJ, tak při HR, respektive se zdá, že je klíčový pro přepínání mezi těmito mechanismy (99, 130). Protein 53BP1 kolokalizuje s gH2AX, přičemž vytváří jaderná ohniska tvarem a velikostí (mikromorfologicky) podobná ohniskům gH2AX (60, 131, 132). Naopak příkladem „specializovaného“ reparačního proteinu může být protein RAD51, který se podílí pouze na HR, kde se uplatňuje v pozdější fázi tohoto procesu, při hledání homologních sekvencí a vytváření triplexových struktur tvořících základní substrát pro reparaci (133). Pomocí imunofluorescenční mikroskopie a nanoskopie (např. SMLM) proto obvykle vizualizujme jaderná ohniska gH2AX společně s alespoň jedním reparačním proteinem nebo různé kombinace reparačních proteinů. Takto můžeme jednak zvýšit spolehlivost detekce a kvantifikace DSB (131), jednak studovat mechanismus a průběh jednotlivých kroků reparace DSB (obr. 5). Spolu s fosforylací histonu H2AX na serinu 139 (gH2AX) můžeme zároveň vizualizovat i další epigenetické modifikace histonů v místech DSB a jejich okolí (134). Tyto experimenty odhalily zásadní úlohu architektury chromatinu jak v indukci, tak reparaci DSB (75, 114, 115, 134).

RADIAČNÍ POŠKOZENÍ A REPARACE DNA V KONTEXTU CHROMATINU

Jak již bylo uvedeno, různé druhy záření se liší charakterem depozice dávky a distribuce ionizací. Tomu odpovídá i odlišná distribuce DSB v buněčném jádře, komplexnost DSB, a následně i jejich opravitelnost. Fotonová záření poškozují DNA především prostřednictvím ROS, z nichž každý dokáže vytvořit jen jednoduchý zlom DNA (SSB), jak již bylo vysvětleno. Pro předání energie 1 Gy je zapotřebí velkého množství fotonů (60, 117, 132), které navíc interagují s hmotou jen zřídka, charakter těchto interakcí je náhodný a foton může ztratit veškerou svou energii v rámci jediné interakce. ROS, sekundárně emitované elektrony, a následně i DSB jsou tudíž v případě expozice buněk fotonovým zářením distribuované v celém objemu jádra. DSB tak mají charakter prostorově rozptýlených, jednoduchých, a tudíž i relativně snadno opravitelných DSB. Při absorbované dávce 1 Gy můžeme v buněčném jádře pozorovat v průměru přibližně 25–35 reparačních ohnisek (DSB) (60).

Hustě ionizující záření vyvolává zcela jiný charakter poškození. Pro předání stejné dávky IZ jako ve výše uvedeném případě, tj. 1 Gy, stačí 1 či několik částic (60). Částice prolétávající buněčným jádrem samy o sobě vytvářejí v DNA dvouřetězcové zlomy, takže zde k indukci jednoho DSB stačí jediná interakce částice s DNA, na rozdíl od dvou ataků ROS potřebných ke stejnému výsledku (21). Nabitá částice navíc předává svou energii postupně, takže podél dráhy jejího letu vzniká řada DSB a dalších poškození DNA (117, 132). Následkem vysoké hustoty ionizací vyvolaných částicí dochází k vysoké produkci ROS a dalších radikálů a jejich kumulaci v úzkém „ionizačním tunelu“ podél dráhy letu částice. Tato vysoká koncentrace radikálů v omezeném objemu způsobuje, že jich část vzájemně rekombinuje za vzniku dále neškodných molekul, stále však zbývá obrovské množství vysoce reaktivních molekul k vytvoření značného množství DSB (135). Další ROS jsou generovány sekundárními (delta) elektrony, které unikají i mimo hlavní ionizační tunel a přispívají k tvorbě klastrovaných i izolovaných DSB. Vzhledem k tomu, že jsou tyto DSB generovány často v těsné vzájemné blízkosti, navíc spolu s dalšími typy poškození DNA, mají mnohé léze DNA po expozici hustě ionizujícímu částicovému záření charakter mnohočetných a/nebo komplexních DSB, které jsou pro buňku jen velmi stěží opravitelné nebo neopravitelné (60, 95, 96). Nezřídka dochází v dráze průletu částice až k lokální fragmentaci chromatinu, takže situaci můžeme metaforicky přirovnat např. k tříštivé zlomenině kosti (obr. 5) (96). Všechny tyto typy DNA lézí tak s sebou nesou vysoké riziko poškození genomu, ale jelikož jsou většinou letální, je pravděpodobnost iniciace sekundárních malignit po hadronové radioterapii „paradoxně“ nižší než po radioterapii fotonovým zářením (136, 137). Radioterapie pomocí urychlených těžkých iontů tudíž ve srovnání s fotonovými typy záření nabízí výrazně efektivnější eradikaci (i hypoxických) nádorů a zároveň lepší ochranu okolní tkáně, jednak díky přesnějšímu zacílení depozice energie záření do objemu nádoru, jednak nižšímu riziku vyvolání sekundárních malignit.

Ještě poznamenejme, že multiplicita, komplexita a opravitelnost DSB lézí závisí zejména na energii a LPT (LET) částice. Situace je zde ale poměrně komplexní, protože i náboj a další parametry částice určují jak charakteristiky samotného průletového kanálu, tak i mikrodozimetrické chování sekundárních (delta) elektronů emitovaných z okolního prostředí (60). Distribuce poškození DNA v buněčném jádře a jejich opravitelnost se proto mohou lišit i pro různé ionty, urychlené tak, aby vykazovaly podobnou energii a LPT (LET) (obr. 6) (60). RBU záření roste s LPT až do hodnoty přibližně 100 keV/mm (138), poté se již projevuje tzv. overkill efekt. Jeho podstatou je skutečnost, že zasažení buněčného jádra, byť jedinou částicí s LPT kolem 100 keV/mm, již vyvolá smrt buňky. Další nárůst LPT proto již nemůže zvyšovat smrtící účinek. S nárůstem LPT však roste energie předávaná 1 částicí, tudíž při dané dávce je s rostoucím LPT k dispozici méně částic, a tedy klesá i počet zasažených a usmrcených buněk. Jinými slovy, na usmrcení 1 buňky se vyplýtvá zbytečně mnoho energie, která pak chybí na usmrcení buněk ostatních (20).

  

Obr. 6  Simulace trajektorií a distribuce sekundárních (delta) elektronů a reaktivních radikálů vytvořených ionty ¹¹B⁵⁺ a ²⁰Ne¹⁰⁺ s podobnými hodnotami LET a (zhruba podobně) nízkou energií (¹¹B⁵⁺: LET 148,3 keV/mm, 7,5 MeV/nukleon; ²⁰Ne¹⁰⁺: LET 170,9 keV/mm, 33,9 MeV/nukleon) (60).
Levé panely (A, B) zobrazují zvětšené úseky (vyznačené žlutými přerušovanými čárami) obrázků na pravých panelech, kde je velikost zvolena tak, aby byly vidět i celé dráhy nejdále letících sekundárních elektronů. Zvětšení obrázků pro ionty ¹¹B⁵⁺ a ²⁰Ne¹⁰⁺ je přitom stejné. Simulace byly provedeny s využitím software RITRACK, poskytovaným kosmickou agenturou NASA (https://software.nasa.gov/software/MSC-25937-1).
Pravé panely (C, D) následně ilustrují, jaký mají rozdíly v distribuci a doletu delta elektronů dopad na poškození DNA v buněčném jádře. V případě iontů ¹¹B⁵⁺ je hlavní ionizační kanál o něco užší než u ²⁰Ne¹⁰⁺, zároveň je také menší dolet delta elektronů. Z toho vyplývá, že tyto dva různé ionty poškozují DNA trochu odlišným způsobem, přestože jsou urychlené na podobný LET a hrubě i energii. Konkrétně ionty ¹¹B⁵⁺ koncentrují podobnou energii jako ionty ²⁰Ne¹⁰⁺ v až příliš úzkém kanálu, což snižuje jejich schopnost indukovat komplexní DSB zlomy ve srovnání s ionty ²⁰Ne¹⁰⁺. Ionty ²⁰Ne¹⁰⁺ navíc díky většímu doletu delta elektronů mohou poškodit i více různých chromosomů, čímž mohou vznikat i komplexnější genomové přestavby (panely C, D).