Nové metody zvyšující úspěšnost asistované reprodukce

New methods increasing assisted reproduction results

Objective:
The brief review of historical development and application of the assisted reproduction methods at our centre and the recent methods increasing the assisted reproduction results. The new mentioned methods are sperm selection before the intracytoplazmatic sperm injection (PICSI = preselected sperm intracytoplasmic injection) and continuous embryo development monitoring.

Design:
Review article.

Key words:
oocyte, sperm selection, embryo, cultivation, insemination, ICSI, PICSI, monitoring.

Autori: J. Žáková; P. Ventruba; I. Crha ; E. Lousová; K. Sochorová; M. Pohanka; M. Huser
Pôsobisko autorov: Gynekologicko-porodnická klinika LF MU a FN Brno, přednosta prof. MUDr. P. Ventruba, DrSc., MBA
Vyšlo v časopise: Ceska Gynekol 2012; 77(2): 139-142
Kategória: Původní práce

Súhrn

Cíl:
Stručný přehled vývoje metod asistované reprodukce na našem pracovišti a představení nově zavedených metod, jejichž cílem je zvýšit úspěšnost asistované reprodukce. Mezi nové metody patří selekce spermií před intracytoplazmatickou injekcí do oocytu, navázáním na molekuly kyseliny hyaluronové (PICSI = preselected sperm intracytoplasmic injection) a kontinuální monitorování vývoje embrya in vitro (Primo Vision System).

Typ studie:
Přehledový článek.

Klíčová slova:
oocyt, spermie, selekce, embryo, kultivace, inseminace, ICSI, PICSI, monitoring.

ÚVOD

První dítě „ze zkumavky“ v ČSSR a v bývalé východní Evropě se na klinice narodilo roku 1982. Úspěchy brněnského kolektivu vzbudily mimořádnou pozornost u nás i v zahraničí.

Asistovaná reprodukce zaznamenala za 30 let výrazný rozvoj. Ve snaze zvyšovat úspěšnost resp. počty vzniklých těhotenství, prodělaly metody léčby poruch plodnosti a laboratorní techniky obrovský rozvoj a staly se nedílnou součástí reprodukční medicíny. Naše centrum průběžně aktivně rozvíjelo a stále rozvíjí nejnovější diagnostické a terapeutické postupy.

PŘEHLED VÝVOJE METOD ASISTOVANÉ REPRODUKCE, JAK BYLY ZAVÁDĚNY NA NAŠEM PRACOVIŠTI

4. 11. 1982 Porod prvního dítěte ze zkumavky v České republice a bývalé východní Evropě (světová priorita metody GIFT – transferu gamet do vejcovodu)
29. 10. 1984 Porod prvního dítěte po metodě IVF v České republice
1991 První zamrazené vzorky spermií
1992 Zahájen program kryokonzervace embryí [13, 16]
1994 Zavedení prodloužené kultivace embryí [10]Začátek standardního provádění mikromanipulačních technik (asistovaného hatchingu. AH) [9, 12]
1995 Zahájen program dárcovství spermií [14].Zavedení techniky intracytoplazmatické injekce spermií (ICSI) a porod prvního dítěte po této metodě oplozování v České republice [11]
1997 Zahájen program dárcovství oocytů a embryí
Zavedení metod získání spermií z nadvarlete (MESA) a varlete (TESE) [7]
1998 Zavedení kryokonzervace spermatu mužů před onkologickou léčbou [2]
2001 Klinické provádění preimplantační genetické diagnostiky (PGD) a dosažení prvního těhotenství po PGD
2005 Kryokonzervace ovariální tkáně u žen před onkologickou léčbou [4]
2006 Zpracování metody získání spermií u mužů s retrográdní ejakulací [6]
2007 Zavedení metody rychlého mrazení – vitrifikace
2008 Provádění nativních cyklů, kdy jsou oocyty získány bez hormonální stimulace nebo s minimální stimulací vaječníků
2010 Zavedení metody selekce spermií před oplozováním metodou ICSI, tzv. PICSI
2011 Kontinuální monitorování vývoje embryí

NOVĚ ZAVEDENÉ METODY VEDOUCÍ KE ZVÝŠENÍ ÚSPĚŠNOSTI ASISTOVANÉ REPRODUKCE – METODY HODNOCENÍ KVALITY GAMET A EMBRYÍ

Dosažení těhotenství závisí kromě mnoha jiných faktorů na kvalitě transferovaných embryí. Kvalita a vitalita embrya vychází největší měrou, pomineme--li kultivační podmínky, z kvality gamet. Dokázat dostupnými prostředky co nejlépe hodnotit kvalitu gamet (oocytů, spermií) a kvalitu a následně výběr embryí k transferu se snaží mnoho metod.

Kvalitu oocytů hodnotíme při jejich získávání nejprve nepřímo hodnocením morfologie komplexu oocyt – cumulus oophorus pod vyhledávacím mikroskopem. Reálnější představu o stavu a zralosti oocytu získáme před oplozováním metodou intracytoplazmatické injekce spermie, kdy jsou oocyty zbaveny buněk cumulus oophorus a corona radiata. Tehdy je dobře patrné, zda jsou již v optimální fázi pro oplozování – v metafázi II, nebo naopak ještě ve stadiu zárodečného váčku. Dále lze hodnotit přítomnost pólového tělíska, jeho tvar, případně fragmentaci. Oocytů je však omezený počet a nelze vybírat, které se budou oplozovat, a které ne.

Spermie má významný podíl na správném oplození oocytu a jeho dalším vývoji. Kvalita spermií pro oplozování se hodnotí podle parametrů jejich koncentrace, pohyblivosti a morfologie. Klasická příprava spermatu založená na migraci nebo sedimentaci spermií vede k získání spermií s lepší motilitou a morfologií. Morfologie a motilita neidentifikuje ovšem další charakteristiky, jako jsou chromozomální aberace, defekty chromatinu a DNA. Znamená to tedy, že takto připravené spermie k inseminaci nejsou selektovány z hlediska optimálního fertilizačního potenciálu.

U zralých spermií byl prokázán výrazně nižší výskyt chromozomálních anomálií (viabilní, bez retence cytoplazmy, nižší fragmentace DNA). Byla tedy vyvíjena řada metod s cílem získat zralé, strukturálně intaktní spermie s vysokou integritou DNA. Mezi tyto metody patří např. selekční metody založené na elektrických a magnetických vlastnostech spermie [3, 8], metody založené na apoptóze spermií, metody založené na ultramorfologii spermie a také selekční metody založené na zralosti membrány spermie [5].

Metoda PICSI je modifikovaná metoda standardního mikromanipulačního oplozování pomocí intracytoplazmatické injekce spermie do oocytu (ICSI) přičemž „P“ pochází ze slova „preselected“ (předem selektovené spermie). Vychází z podstaty, že zralé spermie se vážou na hyaluronan - látku, která obklopuje vajíčko a podílí se na vazbě vajíčko-spermie. PICSI využívá možnosti selekce zralých spermií na základě jejich schopnosti vázat se k hyaluronanovému hydrogelu, protože pouze hlavička zralé spermie nese receptor, který tuto vazbu umožňuje. Při oplození je z akrozomu spermie uvolňován mimo jiné enzym hyaluronidáza, který rozrušuje spoje buněk corona radiata a umožňuje vazbu spermie k zona pellucida.

Praktické provedení metody PICSI spočívá v tom, že výběr zralé spermie (obr. 1) pomocí mikropipety je vizuálně umožněn vazbou spermie ke kapce hyaluronanového hydrogelu na speciálně připravené, komerčně dodávané misce (PICSI Sperm Selection Device MidAtlantic Diagnostics, Inc.) (obr. 2). Životaschopná zralá spermie se pod mikroskopem vyznačuje pohybem bičíku, avšak nevykazuje pohyb, neboť její hlavička je navázána na kapku hydrogelu.

**Obr. 1. Vazba zralých embryí na hyaluronan**

**Obr. 2. Miska pro PICSI Sperm Selection Device**

Metodu PICSI jsme zavedli v roce 2010 a dosahujeme s ní vyššího procenta oplozených oocytů i vyššího pregnancy rate [15]. Lze ji doporučit párům v případě nízkého počtu oplozených oocytů po ICSI nebo nedostatečného vývoje embryí v předchozích cyklech, v případě opakovaných těhotenských ztrát a při nízkých hodnotách spermiogramu.

Kvalita embryí

Ve snaze vybrat co nejkvalitnější embryo na transfer se provádí v průběhu kultivace každodenní hodnocení jeho vývoje. U zygoty se sleduje symetrie prvojader, přítomnost, rozložení a počet jadérek, pólová tělíska a jejich vzájemná pozice. U embryí se hodnotí počet blastomer v závislosti na délce kultivace a jejich morfologie, kterou vyjadřuje pravidelnost blastomer, stupeň fragmentace, počet jader, vakuoly atd.

Klasický způsob hodnocení embryí používaný běžně v laboratořích se provádí jednou denně pod mikroskopem, kdy embrya opouštějí na několik minut konstantní prostředí kultivačního boxu. V loňském roce jsme zavedli kontinuální hodnocení vývoje embryí pomocí zařízení Primo Vision System (Cryo-Innovation Technologies, Hungary). Sestává z kompaktního digitálního inverzního mikroskopu s kamerou umístěného v uzavřeném inkubátoru a z řídicí počítačové jednotky (obr. 3). Kamera každých 15 minut pořizuje 5s záznam, který je zobrazený na monitoru. Embrya jsou pro toto sledování umístěna na speciální misce v médiu pod olejem v 9 samostatných jamkách. Jedna miska je určená vždy pro jednu pacientku. K řídící počítačové jednotce může být připojeno 6 sběrných kamer. Analýza morfologie a dynamiky vývoje se provádí z časosběrného digitálního záznamu na monitoru.

Pravidelnost a rychlost dělení embrya úzce souvisí s jeho správnou životaschopností a dosažením těhotenství. Pravidelné dělení buněk je projevem správného počtu chromozomů a genetické informace v nich obsažené (obr. 4). Odhalení poruch dělení buněk embrya, které je možné právě díky těmto záznamům, umožňuje vyřadit a netransferovat embrya s výskytem chromozomálních abnormalit, které by mohly vést k časným potratům.

**Obr. 4. Pravidelně se dělící embryo se 4 buňkami**

Kontinuální hodnocení je objektivní, neboť podává přesné výsledky dělení buněk podle daného časového harmonogramu. Pomáhá správně rozhodnout při výběru nejkvalitnějšího embrya, neboť je založeno nejen na vývojovém stadiu embrya, ale současně i na posouzení dynamiky jeho vývoje.

ZÁVĚR

Uvedené metody PICSI a výběr embrya na základě kontinuálního monitorování a hodnocení jeho vývoje významně zvyšují úspěšnost asistované reprodukce, zvláště pak jejich kombinace může u některých párů zlepšit výsledky o 10–20 %. Kontinuální sledování vývoje přineslo velký zlom v možnosti hodnotit embrya, neboť ty nejdůležitější momenty v dělení buněk, svědčící o kvalitě embrya, zůstávaly při stacionárním pozorování skryty.

Přes povzbudivé výsledky se stále hledají další klinicky snadno použitelné metody hodnocení kvality gamet i embryí.

Naše centrum asistované reprodukce poskytuje celou šíři nejmodernějších metod vedoucích k úspěšnosti srovnatelné s celosvětovou úrovní. Naší výhodou je, že se jedná o univerzitní centrum s kompletním klinickým zázemím, možností mezioborové spolupráce a zkušeným týmem odborníků.

RNDr. Jana Žáková, Ph.D.

Gynekologicko-porodnická klinika

LF MU a FN Brno

Obilní trh 11

602 00 Brno

e-mail: jzakova@fnbrno.cz

Zdroje

1. Crha, I., Ventruba, P., Mardešić, T., Žáková, J. Dárcovství gamet – biologické, legislativní a etické aspekty. Čes Gynek, 1997, 62, 2, s. 72–75.

2. Crha, I., Ventruba, P., Žáková, J., et al. Survival and infertility treatment in male cancer patients after sperm banking. Fertil Steril, 2009, 91, 6, p. 2344–2348.

3. Fleming, SD., Ilad, RS., Grifin, AM., et al. Prospective controlled trial of an electroforetic method of sperm preparation for assisted reproduction: comparison with density gradient centrifugation. Hum Reprod, 2008, 23, p. 2646–2651.

4. Huser, M., Juránková, E., Crha, I., et al. Kryokonzervace ovariální tkáně – šance na záchranu fertility žen s rakovinou. Čes Gynek, 2007, 72, 1, s. 68–73.

5. Huszar, G., Jakab, A., Sakkas, D., et al. Fertility testing and ICSI sperm selection by hyaluronic acid binding: clinical and genetic aspscts. Reprod Biomed Online, 2007, 14, p. 650–663.

6. Lousová, E., Žáková, J., Beharka,, et al. Retrográdní ejakulace – jedna z příčin mužské neplodnosti. Prakt Gyn, 2008, 12, 1, s. 36–37.

7. Pacík, D., Turjanica, M., Žáková, J. První zkušenosti s technikami MESA a TESE při léčbě infertilních mužů s azoospermií. Rozhl Chir, 1997, 76, 9, s. 463–467.

8. Said, TM., Agarwal, A., Zborowski, M., et al. Utility of magnetic cell separation as a molecular sperm preparation technique. J Androl, 2008, 29, p. 134–142.

9. Ventruba, P., Žáková, J., Adler, J., et al. Mikromanipulace v oblasti zona pellucida embrya: asistovaný hatching 1994–1995. Gynekolog, 1996, 5, s. 37–41.

10. Ventruba, P., Žáková, J., Adler, J., et al. Prodloužená kultivace lidských embryí: srovnání kokultivace na lidských tubárních epiteliích a kultivace v syntetickém médiu. Čes Gynek, 1996, 61, s. 27–33.

11. Ventruba, P., Žáková, J., Crha, I., Němcová, S. Intracytoplasmatická injekce spermie do oocytu a asistovaný hatching – mikromanipulační techniky zvyšující úspěšnost programu fertilizace in vitro. Prakt Gyn, 1, 1997, s. 14–25.

12. Žáková, J., Ventruba, P., Adler, J., et al. Asistovaný hatching – přínosná mikromanipulační technika pro ženy s opakovaně neúspěšným embryotransferem. Čes Gynek, 1996, 61, s. 6–9.

13. Žáková, J., Ventruba, P., Petrenko, M., et al. Factors influencing effectiveness of cryopreserved /thawed embryo transfer. Scr Medica, 1998, 71, 1, s. 49–56.

14. Žáková, J., Ventruba, P., Crha, I., Lousová, E. Sperm Donation Programme at the Centre of Assisted Reproduction in Brno: 1995 – 2005 results. Scr Medica Brno, 2005, s. 323–328.

15. Žáková, J., Lousová, E., Crha, I., et al. PICSI – selekce zralých spermií pro oplození lidských oocytů metodou ICSI. Prakt Gyn, 2010, 14, 4, s. 180–182.

16. Žáková, J., Ventruba, P., Lousová, E., et al. Kryokonzervace buněk a tkání v asistované reprodukci. Prakt Gyn, 2011, 15, 1, s. 16–21.